Fare Yavrusundan Beyaz ve Kahverengi Yağ Deposu Toplama: Fare Yavrusundan Beyaz Yağ Dokusu ve Kahverengi Yağ Dokusunun Toplanması İçin Cerrahi Bir İşlem

Özet

Kaynak: Galmozzi, A. et al. Yenidoğan Farelerden Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin İzolasyonu ve Farklılaşması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, yeni doğmuş bir fareden deri altı beyaz yağ dokusunu ve interskapular kahverengi yağ dokusunu izole etmek için uygulanan cerrahi prosedürü gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Yağ depolarının toplanması ve sindirimi (1. gün)

1. Her yavru için iki adet 1,5 mL'lik tüp hazırlayın: biri kahverengi yağ dokusu (BAT) ve diğeri beyaz yağ dokusu (WAT) için. Her tüpe 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) + 200 μL 2x izolasyon tamponu (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 5 mM glikoz, 100 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), penisilin-streptomisin ve% 4 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini) ekleyin. Solüsyonları steril ve buz üzerinde tutun.
2. Yavruları küçük odalara yerleştirin (örneğin, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğu) ve hipotermik hale gelene kadar buzun üzerine koyun. Yavrular ve buz arasında doğrudan temas olmadığından emin olun. Bilinç kaybını sağlamak için bir pençeyi ucuyla delin ve keskin bir makas kullanarak kafalarını keserek yavrulara ötenazi yapın.
   NOT: Farklı genotiplerle çalışıyorsanız, genotipleme için bir kuyruk biyopsisi (3 mm kesik) toplamak için ek bir tüp hazırlayın. Genotipleme hemen yapılırsa, ötenazi yapılan yavruları yağ depolarını toplamak için diseksiyona kadar buz üzerinde tutun.
3. Tüm depoları sindirmek için gereken kollajenaz miktarını hesaplayın ve tartın. Her tüpe 2x izolasyon tamponunda 50 μL 15 mg / mL kollajenaz tip I ekleyin. Tüm dokular toplanana kadar kollajenazı izolasyon tamponunda tekrar süspanse etmeyin.
4. Deri altı WAT'ı toplamak için, yavrunun karnının etrafındaki cildi kesin (periton yırtılmasından kaçının) ve cildi nazikçe bacakların altına doğru çekin. Cildi almadan, kuadrisepslerin içine veya üstüne yapışık berrak (P1 veya daha genç) veya beyaz (P2 ve daha yaşlı), ince, uzun bir doku olarak görünecek olan yağ kabını dikkatlice toplayın (Şekil 1A, B). Yağ deposunu PBS'de durulayın ve 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren tüplerden birine yerleştirin. Buzda kal.
   NOT: P0 ve P1 fareler en iyi verimi verir. P0-1 yavrularında, deri altı WAT deposu neredeyse şeffaftır. P2 farelerinde ve daha yaşlı farelerde, deponun tanımlanması daha kolaydır çünkü zaten beyaza dönmektedir, bu da tamamen olgunlaşmış, lipit yüklü, beyaz adipositlerin varlığını gösterir.
5. İnterskapular BAT'ı toplamak için, cildi omuz bıçaklarından başın üzerine çekin. Kürek kemikleri arasındaki koyu kırmızı doku olan BAT'ı kaldırın ve vücuttan ayırmak için etrafına dikkatlice kesiler yapın (Şekil 1A, B). Tutarlılığı ve rengi kontrol edin; PBS ile durulayın; 250 μL PBS + 200 μL 2x izolasyon tamponu içeren diğer tüpe yerleştirin; ve buzda devam et.
   NOT: P2 farelerinden ve daha eski farelerden BAT toplarken, BAT'ı çevreleyen beyaz yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Deri ile kürek kemikleri arasında daha derin olan BAT arasında bulunan ince, yumuşak, beyaz bir adiposit tabakasından oluşur.

Sonuçlar

Şekil 1: Yağ yastıkçıklarının toplanması ve işlenmesi. (A) Birincil beyaz (üst) ve kahverengi (alt) adiposit izolasyonunun şematik gösterimi. (B) Deri altı beyaz (üst) ve kahverengi (alt) yağ depoları. P0 farelerde, deri altı WAT neredeyse görünmezdir, ancak doğumdan sonraki ~ 2. günde ayırt edilebilir hale gelir. Buna karşılık, BAT, P0'da bile belirgin bir koyu renge...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oyuklu plakalar	Corning	353046
Yağ asidi içermeyen BSA	Sigma-Aldrich	A8806
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
glikoz	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich	H3375
Kartal	Sigma-Aldrich	P9333 Serisi
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi
Kalem/Strep	Gibco (Gibco)	15140122
Cerrahi forseps	ROBOZ Cerrahi Alet A.Ş.	RS-5158
Cerrahi Makas	ROBOZ Cerrahi Alet A.Ş.	RS-5880
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco (Gibco)	14190144

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi