Kolonoskopik Kılavuzlu Murin Yara Modeli: İyileşme Sürecini Anlamak İçin Biyopsi Kaynaklı Yara Yatağını Kolondan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Montrose, D.C., et al. Farelerde Kolonoskopik Kılavuzlu Tutam Biyopsileri Yapılması ve Sonraki Doku Değişikliklerinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, ayrıntılı moleküler analiz için kolonoskopik indüklenen yara yatağını uygun bir zaman noktasında izole etmek için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu analiz, gastrointestinal sistemin enflamatuar koşullarında yara iyileşme sürecini anlamaya yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Moleküler analiz için yara yatağının toplanması

1. Biyopsiyi takip eden seçilen günde CO₂ asfiksiasyonu ve ardından servikal dislokasyon (veya eşdeğer teknik) kullanarak fareye ötenazi yapın.
2. Vücut boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi ve karın kasını açarak kolonun distal bölgesini hasat edin. Kapalı makası kolonun altına yerleştirin ve alttaki mezenterden serbest bırakmak için hafifçe kaldırın ve ardından kolonu fareden çıkarmak için orta noktasından ve anüsünden kesin.
3. Buz gibi soğuk 1x PBS ile doldurulmuş 20 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir sıçan gavaj iğnesi kullanarak dışkı içeriğini yıkayın, ardından kolonu filtre kağıdına yerleştirin.
4. Mezenterik tarafın filtre kağıdına bakacak şekilde bakacak şekilde kolonu filtre kağıdında uzunlamasına kesin. Doku hala filtre kağıdı üzerindeyken bir sıkma pipeti kullanarak mukozaya %0,2 metilen mavisi uygulayın ve ardından fazla metilen mavisini boşaltın. Kolonu diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve yara yatağını bulun (Şekil 1A).
5. 4 inçlik mikro iris makası kullanarak, kas tabakasını kesmemeye dikkat ederek (kas istenmedikçe) yara yatağının kenarından kesin (Şekil 1A, kesikli daire) ve disseke yara yatağını çıtçıtlı dondurma veya istenen saklama yöntemi için ince uçlu cımbız kullanarak bir tüpe aktarın.
   not: Bu şekilde toplanan doku miktarı, RNA-seq veya eşdeğer analiz için RNA'nın çıkarılması için yeterlidir.

Sonuçlar

Şekil 1: Yara yatağının ex vivo ve kesitli görüntüleri. (A) Biyopsiden 2 gün sonra bir fareden bir kolon alındı, %0.2 metilen mavisi ile boyandı ve diseksiyon mikroskobu altında görüntülendi. Kesikli daire, yara yatağının kenarlarını gösterir. Siyah çizgi, kesit için gömmeden önce yara yatağını/kolonu ikiye bölmek için uygun yeri gösterir. (B) Bir yara yatağının H&E lekeli bir bölümünün temsili gö...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyopsi forseps, 3 Fr	Karl Storz ·	61071ZJ
izofloran	Koy	2905
Metilen Mavisi	Sigma-Aldrich	M9140
Mikro İris Makası	Bütünleşik	18-1619
#10 bıçaklı kafa derisi	Tepe-Rom	372610