Fare ileal döngü modeli: farede bağırsak geçirgenliğini incelemek için cerrahi bir model

Abstract

Kaynak: Boerner, K., et al. Standartlaştırılmış Bağırsak Döngü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepitelyal Migrasyonunun Fonksiyonel Değerlendirmesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, bir fare modelinde bağırsak geçirgenliğini incelemek için bir ileal döngü modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Bu yöntem, epitelyal bariyer fonksiyonunu ve buna bağlı immün yanıtı anlamak için canlı bir model sağlar.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. İleal döngünün oluşturulması

1. Cilt hazırlığı: Karın orta hattının kürkünü alkollü bezler veya %70 Etanol ile ıslatılmış gazlı bez süngerle ovalayın. Hipotermiyi önlemek için geniş bir kürk alanını alkolle ıslatmayın.
2. Makas kullanarak orta hat laparotomisi yapın. Karnın ortasında (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) dikey bir kesi yapın ve peritonu ortaya çıkarın. Karın içi organlara zarar vermemeye dikkat edin.
3. Önceden kesilmiş ıslak pamuklu gazlı bezi açıkta kalan karın içi boşluğun üzerine yerleştirin.
4. Çekumu harekete geçirmek ve dışsallaştırmak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın. Çekumu dikkatlice ıslak pamuklu gazlı bez üzerine yerleştirin.
   not: Caecum, çoğu farede hayvanın cinsiyetinden bağımsız olarak karın boşluğunun sol kaudal kadranında lokalizedir.
5. Terminal bölümü (distal uç) çekuma bağlı olan ileumu harekete geçirmek ve nazikçe dışlamak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın (Şekil 1B).
6. Mezenterik damarları ve kan akışını bozmadan ıslak pamuklu gazlı bez üzerine en az 6 cm terminal ileum yerleştirin. Kanama olmadığında kanlanma sağlanır ve doku pembe rengini korur (Şekil 1B).
   not: Sarı bir besleme tüpüne önceden takılmış 10 mL şırınga kullanarak dokuları ılık HBSS ile (her 2-3 dakikada bir) her zaman nemli tutarak maruz kalan dokuların kurumasını önleyin.
7. Çekuma yakın, mezenterdeki ana arteri tanımlayın ve ileuma kan sağlayın. Daha sonra mezenterde kritik kan damarlarından arınmış iki ligasyon bölgesi bulun.
8. Künt doku forsepsleri kullanarak, terminal ileumu (çekuma en yakın) sıkıca tutun ve ince uçlu forseps kullanarak, kan damarlarından kaçınarak mezenteri fenestrate edin. İpek dikişi perforasyonun üzerine yerleştirin ve ilk ligasyonu (ilmeğin distal ucu) oluşturmak için cerrahi bir düğüm atın.
9. İlk bağdan 4 cm uzakta ölçmek için cetveli kullanın ve adım 2.8'de belirtildiği gibi ikinci bitişik harfi (döngünün proksimal ucu) oluşturun (Şekil 1C).
10. 4 cm'lik ileal halkayı izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesilmiş ince makasla, kan akışını ve mezenterik membranı sağlam tutun.
    not: iLoop'un dışlanmış segmentinin her iki ucunu kesin, ardından luminal içeriklerle (dışkı maddesi) etkileşimi önleyen gerekli bir adım olarak nazikçe yıkayın, böylece FITC-dekstran veya kemotaktik uyaranların izole segmentin tüm uzunluğu boyunca eşit dağılımını kolaylaştırır ve ayrıca akış sitometrisi ile lökositlerin daha doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bu prosedür aynı zamanda, belirli hacimlerde reaktifin enjeksiyonundan sonra mukozanın homojen bir şekilde şişirilmesine ve hayvanlar arasında daha iyi tekrarlanabilirliğe izin verir.
11. 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı esnek sarı bir besleme tüpü kullanarak ileal döngü segmentinin içeriğini ılık HBSS ile nazikçe yıkayın.
12. Yıkanmış ileal ilmeğin kesilen iki ucunu ipek sütür kullanarak bağlayın.
13. FITC-dekstran veya kemokin gibi 250 μL reaktifi bağırsak lümenine yavaşça enjekte etmek için 30 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanın. İleal döngü şişer ve mukozanın orta derecede şişmesine neden olur (Şekil 1D).
    not: Mezenterik arterin karşı tarafındaki halka lümenine reaktif enjekte edin. Kan damarlarının yırtılmasını ve kanamaya neden olmasını önlemek için enjeksiyon sırasında ileal halkayı hayvandan çıkarmamaya dikkat edin.
14. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, ileal halkayı, proksimal ileumu ve çekumu nazikçe geri koyun.
15. Karın duvarını kapatmak için iğne tutucu, anatomik forseps ve ters kesme iğneli 3.0 emilmeyen ipek dikişler kullanın.
16. Hayvanı kuluçka süresi boyunca sıcaklık ayarlı bir anestezi odasına yerleştirin.

Results

Şekil 1: İleal döngü modeli. (A) İleal döngü modeline şematik genel bakış. Median laparotomi, anestezi altında farelere yapılır ve sıcaklık kontrollü bir ameliyat tahtasına yerleştirilir. (B) Çekum (*), ileum ve mezenterin dıştan alınması. Ligasyon için iki uygun bölge tanımlanmıştır (1,2). (C) 4 cm uzunluğunda bir segmenti izole edin: birinci bağ (1) ileo-çekal bileşkeye yakın yerleştirilir ve ikinci...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman ve Malzeme
BD Alkollü Swablar	Bd	326895
BD PrecisionGlide İğne, 25G x 5/8"	Bd	305122
BD PrecisionGlide İğne, 30G x 1/2"	Bd	305106
BD 1ml İğnesiz Tüberkülin Şırıngası	Bd	309659
15ml Santrifüj Tüpü	Corning	14-959-53A
Corning 96 Kuyulu Katı Siyah Polistiren Mikroplaka	Balıkçı Bilimsel	07-200-592
Corning İşlenmemiş Kültür Kabı, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Pamuk Uçlu Aplikatör (pamuklu çubuk), 6", steril	Balıkçı Bilimsel	25806 2WC
Dynarex Pamuk Dolgulu Gazlı Bez Süngerler, Steril Olmayan, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anestezi buharlaştırıcı (Klasik Sistem, ısıtma üniteleri dahil)	E-Z Sistemleri	EZ-7000 Serisi
Moria İnce Makas	FST (Türkçe)	14370-22
Puralube Veteriner Merhemi, Steril Oküler Kayganlaştırıcı	Kır	12920060
Yüzük Forseps (künt doku forsepsleri)	FST (Türkçe)	11103-09
Roboz Cerrahi 4-0 İpek Siyah Örgülü, 100 YD	Balıkçı Bilimsel	NC9452680
Semken Forseps (anatomik forseps)	FST (Türkçe)	1108-13
Sofsilk Emilmeyen Kaplamalı Siyah Sütür Örgülü İpek Boyut 3-0, 18 ", İğne 19mm uzunluk 3/8 daire ters kesme	Henry Schein ·	SS694
Öğrenci İnce Forseps, Açılı	FST (Türkçe)	91110-10
10ml Şırınga PP / PE iğnesiz	Kırlangıç Sigma	Z248029
Kemirgenler için Sarı Besleme Tüpleri 20G x 30 mm	Bilişim Teknolojileri	FTP-20-30
Çözeltiler ve Tamponlar
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi	Corning	21-023-Özgeçmiş
Kalsiyum ve Magnezyum İçermeyen Fosfat Tamponlu Salin	Corning	21-040-Özgeçmiş
İzofluran	Halokarbon	12164-002-25