Fare ileal döngü modeli: farede bağırsak geçirgenliğini incelemek için cerrahi bir model

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. İleal döngünün oluşturulması

1. Cilt hazırlığı: Karın orta hattının kürkünü alkollü bezler veya %70 Etanol ile ıslatılmış gazlı bez süngerle ovalayın. Hipotermiyi önlemek için geniş bir kürk alanını alkolle ıslatmayın.
2. Makas kullanarak orta hat laparotomisi yapın. Karnın ortasında (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) dikey bir kesi yapın ve peritonu ortaya çıkarın. Karın içi organlara zarar vermemeye dikkat edin.
3. Önceden kesilmiş ıslak pamuklu gazlı bezi açıkta kalan karın içi boşluğun üzerine yerleştirin.
4. Çekumu harekete geçirmek ve dışsallaştırmak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın. Çekumu dikkatlice ıslak pamuklu gazlı bez üzerine yerleştirin.
   not: Caecum, çoğu farede hayvanın cinsiyetinden bağımsız olarak karın boşluğunun sol kaudal kadranında lokalizedir.
5. Terminal bölümü (distal uç) çekuma bağlı olan ileumu harekete geçirmek ve nazikçe dışlamak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın (Şekil 1B).
6. Mezenterik damarları ve kan akışını bozmadan ıslak pamuklu gazlı bez üzerine en az 6 cm terminal ileum yerleştirin. Kanama olmadığında kanlanma sağlanır ve doku pembe rengini korur (Şekil 1B).
   not: Sarı bir besleme tüpüne önceden takılmış 10 mL şırınga kullanarak dokuları ılık HBSS ile (her 2-3 dakikada bir) her zaman nemli tutarak maruz kalan dokuların kurumasını önleyin.
7. Çekuma yakın, mezenterdeki ana arteri tanımlayın ve ileuma kan sağlayın. Daha sonra mezenterde kritik kan damarlarından arınmış iki ligasyon bölgesi bulun.
8. Künt doku forsepsleri kullanarak, terminal ileumu (çekuma en yakın) sıkıca tutun ve ince uçlu forseps kullanarak, kan damarlarından kaçınarak mezenteri fenestrate edin. İpek dikişi perforasyonun üzerine yerleştirin ve ilk ligasyonu (ilmeğin distal ucu) oluşturmak için cerrahi bir düğüm atın.
9. İlk bağdan 4 cm uzakta ölçmek için cetveli kullanın ve adım 2.8'de belirtildiği gibi ikinci bitişik harfi (döngünün proksimal ucu) oluşturun (Şekil 1C).
10. 4 cm'lik ileal halkayı izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesilmiş ince makasla, kan akışını ve mezenterik membranı sağlam tutun.
    not: iLoop'un dışlanmış segmentinin her iki ucunu kesin, ardından luminal içeriklerle (dışkı maddesi) etkileşimi önleyen gerekli bir adım olarak nazikçe yıkayın, böylece FITC-dekstran veya kemotaktik uyaranların izole segmentin tüm uzunluğu boyunca eşit dağılımını kolaylaştırır ve ayrıca akış sitometrisi ile lökositlerin daha doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bu prosedür aynı zamanda, belirli hacimlerde reaktifin enjeksiyonundan sonra mukozanın homojen bir şekilde şişirilmesine ve hayvanlar arasında daha iyi tekrarlanabilirliğe izin verir.
11. 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı esnek sarı bir besleme tüpü kullanarak ileal döngü segmentinin içeriğini ılık HBSS ile nazikçe yıkayın.
12. Yıkanmış ileal ilmeğin kesilen iki ucunu ipek sütür kullanarak bağlayın.
13. FITC-dekstran veya kemokin gibi 250 μL reaktifi bağırsak lümenine yavaşça enjekte etmek için 30 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanın. İleal döngü şişer ve mukozanın orta derecede şişmesine neden olur (Şekil 1D).
    not: Mezenterik arterin karşı tarafındaki halka lümenine reaktif enjekte edin. Kan damarlarının yırtılmasını ve kanamaya neden olmasını önlemek için enjeksiyon sırasında ileal halkayı hayvandan çıkarmamaya dikkat edin.
14. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, ileal halkayı, proksimal ileumu ve çekumu nazikçe geri koyun.
15. Karın duvarını kapatmak için iğne tutucu, anatomik forseps ve ters kesme iğneli 3.0 emilmeyen ipek dikişler kullanın.
16. Hayvanı kuluçka süresi boyunca sıcaklık ayarlı bir anestezi odasına yerleştirin.

Şekil 1: İleal döngü modeli. (A) İleal döngü modeline şematik genel bakış. Median laparotomi, anestezi altında farelere yapılır ve sıcaklık kontrollü bir ameliyat tahtasına yerleştirilir. (B) Çekum (*), ileum ve mezenterin dıştan alınması. Ligasyon için iki uygun bölge tanımlanmıştır (1,2). (C) 4 cm uzunluğunda bir segmenti izole edin: birinci bağ (1) ileo-çekal bileşkeye yakın yerleştirilir ve ikinci bir bağ (2) birinci bağdan 4 cm uzağa yerleştirilir. (D) 4 cm uzunluğunda bir ileal halka oluşturmak için mezenterde (1, 2) iki küçük kesi yapılır. Luminal içeriğin çıkarılmasından ve kesik uçların ligasyonundan sonra, lümene floresan işaretleyiciler ve kemo-cezbedanlar gibi reaktifler enjekte edilebilir. İleal döngü iyi vaskülarize edilmiştir (siyah ok uçları).