Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. EDL kas izolasyonu ve kollajenaz sindirimi
- Kontaminasyonu önlemek için tüm ekipmana %70 etanol püskürtün.
- Fareyi, hayvan deneyleri için ulusal düzenlemelere uygun olarak kurban edin.
- Farenin arka ayaklarına% 70 etanol püskürtün. Cildi çıkarmak ve alttaki kasları ortaya çıkarmak için sertleştirilmiş ince kavisli makas (24 mm kesici kenar) ve ince forseps (Dumont 7, kavisli veya düz) kullanın. Altta yatan kasların kürkle herhangi bir temasından kaçının (kontaminasyon riskini artırır).
- Çevredeki fasyayı, alttaki kaslara zarar vermeden ince kavisli forseps ile çıkarın (Şekil 1A). Bükülmeyi önlemek için forsepsleri kapatın.
- TA (tibialis anterior) ve EDL kasının distal tendonlarını ortaya çıkarmak için kavisli forseps kullanın. TA'yı çıkarmak için distal TA tendonunu forseps ile tutun ve ince Vannas yaylı makasla (5 mm kesme kenarı, 0,35 mm uç çapı) kesin. TA'yı tendonda tutarken dizine doğru çekin ve dize yakın kası kesin (Şekil 1B), EDL kası artık açığa çıkar.
not: Bu adımda sadece TA tendonunun tutulduğundan emin olun, aksi takdirde alttaki EDL hasar görebilir. TA kasını keserken, dizdeki tendonların daha sonra kolayca görülebildiğinden emin olun.
- Distal EDL tendonunu ince kavisli forseps ile kaldırın ve ince Vannas yaylı makasla kesin (Şekil 1C). EDL'yi dikkatlice dizinize doğru çekerek proksimal EDL tendonunu ortaya çıkarın. Proksimal tendonu ince Vannas yaylı makasla kesin. EDL kasını 15 mL reaksiyon tüpünde 37 ° C önceden ısıtılmış 2.5 mL kollajenaz sindirim çözeltisine aktarın. Kollajenaz çözeltisi bu prosedüre göre hazırlanır:
- % 0.2 (a/h) kollajenaz tip 1'i (Clostridium histolyticum'dan) DMEM'de (Dulbecco'nun 4.5 g / L glikoz ve sodyum piruvat ile modifiye edilmiş Eagle ortamı) çözerek kollajenaz sindirim çözeltisi hazırlayın, 0.22 μm filtreden süzün. (Şekil 1D).
not: Proksimal EDL tendonunu tamamen ortaya çıkarmak için dış diz bağ dokusunda küçük bir kesi yapın. Sadece tendonları tuttuğunuzdan ve EDL'yi çok fazla germediğinizden emin olun.
- İkinci EDL ile 1.3. ila 1.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Her iki EDL kasını da 2.5 mL kollajenaz sindirim çözeltisi ile doldurulmuş aynı 15 mL reaksiyon tüpüne ekleyin.
- EDL kaslarını reaksiyon tüpünde 37 ° C'de dolaşan bir su banyosunda inkübe edin.
not: Kuluçka süresi, kollajenaz aktivitesi, farenin yaşı ve fibrotik doku miktarı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Yetişkin farelerin (2-6 aylık) EDL kasları için tipik kuluçka süresi 1-1.5 saat ve yaşlı fareler (18 aylık) için 1.5-2 saattir.
- Kasların aşırı sindirimini önlemek için, sindirim süresi boyunca kasları kontrol edin. Kaslar gevşediğinde ve tek miyolifler göründüğünde sindirimi durdurun (Şekil 1E). Aşağıdaki gibi hazırlanan miyofiber izolasyon ortamı içeren önceden ısıtılmış 12 oyuklu plakanın ilk kuyucuğuna büyük delikli pipet ile kasları dikkatlice aktarın (Şekil 1G):
- DMEM'i (Dulbecco'nun 4.5 g / L glikoz ve sodyum piruvat içeren modifiye edilmiş Eagle ortamı)% 20 FBS (fetal sığır serumu) ile destekleyin, 0.22 μm filtreden süzün. İzolasyondan yaklaşık 30 dakika önce önceden kaplanmış izolasyon plakalarına (12 oyuklu plaka, oyuk başına 2-4 mL izolasyon ortamı) ortam ekleyin ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde dengeleyin.
2. Miyofiber ayrışması
- Aşağıdaki adımlar için, tercihen bir ısıtma plakası (37 °C) ile donatılmış bir stereo binoküler mikroskop kullanın. Tek miyofiberler serbest kalana kadar kasları ılık izolasyon ortamıyla yıkamak için büyük delikli pipeti kullanın. İstenilen sayıda miyofiber solüsyonda serbestçe yüzene kadar kasları büyük delikli pipetle ayırın.
not: Hasarlı miyofiber riskini azaltmak için aşırı aşınmadan kaçının. Miyofiber ayrışması için bir ısıtma plakası kullanılması şiddetle tavsiye edilir, çünkü izolasyon işlemi sırasında sıcaklık düşer ve bu da miyofiber ölümüne neden olur.
