Bakteriyel Endoftalmi Fare Modeli: Farenin Gözüne İntravitreal Bakteriyel Süspansiyon Enjeksiyonu Yoluyla Bakteriyel Endoftalmi Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Mursalin, M. H. ve ark., Bakteriyel Endoftalmisin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Kantitasyonu. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, göze intravitreal bir bakteri süspansiyonu enjeksiyonu yoluyla bakteriyel endoftalmiyi (gözün vitreus boşluğuna bakteri istilasından kaynaklanan bir göz içi enfeksiyonu) taklit eden bir fare modeli oluşturma yöntemi açıklanmaktadır. Bu fare modeli, hastalık mekanizmasını incelemeye ve bunun için terapötikleri değerlendirmeye yardımcı olur.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Steril cam iğneler

1. İğne pipet çekicisini açın.
2. Isıtıcı düğmesini ekranda 12.6 görünene kadar ayarlayın.
3. Kapıyı açın ve 5 μL'lik kılcal boruyu üst cl'den manuel olarak besleyinamp ve borunun yarısı filamanın altına uzanana kadar ısıtıcı filament (Şekil 1A).
4. Kılcal borunun üst kelepçedeki "V" oluğunda olduğunu onaylayın. Üst kelepçeyi sıkın.
5. Alt kelepçe açıkken, alt kelepçe üst sınırına ulaşana kadar dikey sürgüyü manuel olarak yukarı ayarlayın. Borunun alt kelepçedeki "V" oluğunda olduğunu onaylayın. Alt kelepçeyi sıkın.
6. Kapıyı kapatın ve 'Hazır' ışığının yandığını onaylayın. Isıtıcıyı ve çekme sırasını başlatmak için Başlat düğmesine basın (Şekil 1B).
7. Isı ve yerçekimi kılcal boruyu ayırdıktan sonra ısıtıcının otomatik olarak kapandığından emin olun (Şekil 1C) ve sürgü aşağı doğru hareket eder.
8. Kapıyı aç. Kılcal borunun üst kısmını tutarken, üst kelepçeyi gevşetin. Üst kılcal boruyu çıkarın ve bir kenara koyun.
9. Kılcal boruyu alt sürgüde tutun ve alt kelepçeyi gevşetin. Alt kılcal boruyu çıkarın ve bir kenara koyun.
10. Enjeksiyon iğnelerini oluşturmak için çekilen kılcal boruyu eğim vermek için 0.05 μm alümina aşındırıcı taşlama plakasına sahip bir mikroelektrot düzenleyici kullanın.
11. Yüzeyi kaplayacak kadar öğütme plakasına yeterince su pipetleyin (Şekil 1D).
12. Eğimi 60 rpm'de dönmeye başlayacak şekilde açın. Çekilen kılcal boruyu "V" oluğundaki pipet kelepçesine yerleştirin. Kelepçeyi sıkın ve pipet kelepçesinin açısını 30°'ye ayarlayın.
13. Kılcal borunun sivri kenarının ucunu, taşlama plakasının dönme merkezinden yaklaşık üçte iki mesafe uzağa ayarlayın.
14. Manipülatörün üst kısmındaki kaba kontrol düğmesini ayarlayarak kelepçeli kılcal boruyu indirin. Kılcal borunun ucu su yüzeyinin altına uzanana ve taşlama plakasının aşındırıcı yüzeyine temas edene kadar kılcal boruyu indirmeye devam edin.
Kaynak ağzı açı eğimine
15. takılı mikroskobu kullanarak eğim verme ilerlemesini izleyin. 5 dakika sonra, cam iğneyi taşlama plakasından kaldırmak için ince kontrolü ayarlayın.
16. Kılcal borunun ucunu kontrol etmek için cam iğneyi çıkarın ve 10x büyütme altına yerleştirin (Şekil 1E,F).
17. Tıkanıklık olmadığından emin olmak için, cam iğneyi bir şırınga üzerindeki pipet tutucusuna yerleştirin ve havayı 1 mL'lik %99 etanol tüpüne itin. İğnenin ucunda hava kabarcıkları oluşursa, iğnede tıkanıklık yoktur ve mikroenjeksiyon için kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda cam iğnelerin sterilliğini de sağlar.
18. Bir kılcal tüp 5 μL'ye kadar sıvı tutabilir. 0,5 μL hacimleri işaretlemek için iğne üzerindeki mesafeleri hesaplamak için kılcal boruyu 10 bölüme işaretleyin. Gelecekteki hazırlık için 0,5 μL tutan bu mesafeye sahip bir ölçek işaretleyin. 5 μL'lik bir iğne için, 0,7 mm'lik mesafeler 0,5 μL'ye eşittir (Şekil 1G).

>2. Fare intravitreal enjeksiyonu

1. Bu bölümdeki tüm prosedürleri Biyogüvenlik Seviye 2 koşulları altında gerçekleştirin.
2. Ameliyat masasına tıbbi alt pedler yerleştirerek işlem bölgesini hazırlayın.
3. Mikroenjektörü açın ve mikroenjektöre bağlı basınçlı hava deposundaki gaz vanasını açın. Tank regülatörünü, gaz dağıtımı yaklaşık 60 psi olana kadar ayarlayın.
4. Mikro enjektörde, ekranda Balance (Denge) görünene kadar Mode (Mod) düğmesine basın. Balance (Denge) tuşuna basın ve bilgisayar faresini ameliyat masasının üzerine yerleştirin. Paslanmaz çelik pipet tutucuyu enjektörün 'Doldurma/Çıkış' bölümüne bağlı boruya bağlayın. Bu tüp her zaman enjektöre bağlıdır.
5. Pipet tutucu konektörünü iğnenin etrafına sıkıca vidalayarak kılcal iğneyi pipet tutucunun diğer ucuna yerleştirin.
6. Oftalmik mikroskobu açın ve ışığını% 50 yoğunluğa getirin. Mikroskobu ameliyat masasındaki işlem bölgesinin üzerine ayarlayın ve mikroskobu istenen odağa ayarlayın.
7. Prosedür başlamadan önce, pedal çekme refleksini test ederek farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Anestezi için IACUC onaylı protokolünüzü takip ettiğinizden emin olun.
8. Anestezi uygulanmış fareyi, burnu sağa bakacak ve sol tarafına yaslanacak şekilde tıbbi alt pedlerin üzerine yerleştirin.
9. Oftalmik mikroskop ile farenin sağ gözüne bakın ve enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için gözün her iki yanındaki ters etkili forsepsin maşasını açarak kapakları açın (Şekil 2C).
10. Mikroenjektöre bağlı mouse pad'e sol tıklayarak kılcal iğneyi Bacillus cereus (ATCC 14579) bakteri solüsyonu (200 CFU/μL seyreltme) ile doldurun (Şekil 2D).
11. Hayvanın kafasını sol elinizle sabitleyin ve iğnenin ucunu gözün limbusuna yerleştirin. İğne eğim yukarı konumda ve 45° açıyla fare gözünü delin, ancak enjeksiyon sırasında yalnızca iğnenin keskin ucunun (~0.5 mm) sokulduğundan emin olun.
12. İğne ucu yerleştirildikten sonra, sol elinizi fare kafasından fare altlığına doğru hareket ettirin ve Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyunda hazırlanan 0,5 μL B. cereus seyreltmesini enjekte etmek için fare altlığına sağ tıklayın. Sızıntıyı önlemek için, çıkarmadan önce iğne ucunu fare gözünün içinde 2-3 saniye bırakın (Şekil 2E).
13. Forsepsleri serbest bırakın ve fareyi bir ısınma pedi üzerinde oturan bir kafese yerleştirin. Bu fareleri anesteziden kurtulana kadar izleyin (Şekil 2F).
14. Fareler anesteziden kurtulduktan sonra, kafesi uygun rafına geri koyun. Fareler elektroretinografi ile retina fonksiyon analizine tabi tutulacaksa, uygun karanlık adaptasyon için kafesler karanlık bir odaya geri gönderilmelidir.

Results

Şekil 1: Eğimli cam iğneler yapmak. Cam iğneler, bir iğne/pipet çektirme ve bir mikropipet toplayıcı kullanılarak tek kullanımlık mikrokılcal pipetlerden yapılmıştır. (A) İğne / pipet çekicisine sıkıştırılmış cam kılcal boru. (B,C) İstenilen voltajı kullanarak cam iğnelerin oluşturulması. (D) Cam mikropipetlerin eğimini vermek. (E,F) ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hücre Mikroenjektörü	MicroData Enstrüman, Inc.	PM2000 Serisi	Na
Mikrokapiler Pipetler 5 Mikrolitre	Kimble	71900-5	Na
Mikro Pipet Beveler	Sutter Enstrüman A.Ş.	BV-10	Na
Mikroskop OPMI Lumera	Zeiss		Na
Ters hareket forseps	Katena	K5-8228	Na