$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hasat tüpü hazırlığı
- 1,5 mL vidalı kapaklı tüplere 1 mm steril cam boncuklar yerleştirin.
- Bu tüpleri kuru bir ortamda otoklavda sterilize edin. Kullanmadan önce tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
- Steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- Tüpe 1 tablet proteaz inhibitörü kokteyl tableti ekleyin. Girdap yaparak karıştırın.
- Her otoklavlanmış hasat tüpüne proteaz inhibitörü içeren 400 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) pipetleyin. Tüpleri etiketleyin ve buzun üzerine yerleştirin. (Şekil 1A).
2. Gözleri hasat etmek
- Bu bölümdeki tüm prosedürleri Biyogüvenlik Seviye 2 koşulları altında gerçekleştirin.
- Fareyi CO2 soluma ile ötenazi yapın. Ötenaziyi doğrulamak için ikincil bir yöntem kullanın.
- Ötenazi yapılmış fare kafasını güvenli tutun ve enfekte olmuş gözün her iki yanındaki ince uçlu forsepsleri açın. Gözü desteklemek için başa doğru aşağı doğru itin. Maşa göz küresinin arkasına geçtiğinde, maşayı birbirine sıkın. Göz küresini ayırmak için forsepsleri kafadan uzaklaştırın (Şekil 1B).
- Göz küresini hemen etiketli bir hasat tüpüne yerleştirin. Tüpleri en fazla 60 dakika buzun üzerine yerleştirin (Şekil 1C).
3. Göz içi bakteri sayımı
- Bu bölümdeki tüm prosedürleri Biyogüvenlik Seviye 2 koşulları altında gerçekleştirin.
- Doku homojenizatöründeyken tüm hasat tüplerinin sıkıca kapatıldığını ve dengelendiğini onaylayın (Şekil 2A). Numuneleri homojenize etmek için doku homojenizatörünü 1 dakika boyunca açın. 30 saniye bekleyin, ardından bir dakika daha açın. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin (Şekil 2B,C).
- 20 μL homojenatı 180 μL steril 1x PBS'ye sırayla aktararak her bir numuneyi 10 kat seri olarak seyreltin. 10-7 faktöre ulaşılana kadar seyreltin (Şekil 2D).
- Ilık, kare bir BHI plakasının her sırasını uygun seyreltme faktörleriyle etiketleyin. Her seyreltmenin 10 μL'sini arka arkaya yaklaşık 45° eğimli üst BHI plakasına aktarın. Numuneyi neredeyse plakanın dibine ulaşana kadar çalıştırın, ardından plakayı düz bir şekilde yatırın (Şekil 2E).
- Numune BHI agarına emildiğinde, plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. Koloniler inkübatöre yerleştirildikten 8 saat sonra görünür olmaya başlamalıdır.
- B. cereus kolonilerinin büyümesi tek tek kolonilerin tanımlanmasına müdahale etmeden önce plakayı inkübatörden çıkarın (Şekil 2F).
- Numunedeki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10-100 koloni arasında olan satırı sayın. Örneğin, 45 koloniye sahip seyreltme fraksiyonu 10-4 olan bir satır, 4.5 x 105 CFU/mL'lik bir konsantrasyona sahip olacaktır.
- Göz başına toplam bakteri sayısını hesaplamak için, konsantrasyonu, gözü homojenize etmek için kullanılan 1x PBS'nin mililitre hacmini temsil eden 0,4 ile çarpın. Örneğin, 4.5 x 105 CFU / mL konsantrasyonu, göz başına 1.8 x 105 CFU B. cereus'a dönüşecektir.
