Ex vivo Akciğer Perfüzyonu: Bir Tavşan Modelinde Pulmoner Araştırma Tekniği

Özet

Kaynak: Pacheco-Baltazar, A., et al., Tavşan Modelinde İzole Akciğer Perfüzyon Sistemi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda izole akciğer perfüzyonu için ex vivo bir teknik gösterilmektedir. Akciğer nakli prosedürlerinde yer alan çeşitli fizyolojik ve patolojik mekanizmaların çalışmalarına yardımcı olacak pulmoner araştırmalar için bir araçtır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kanülasyon:

1. Taze izole edilmiş tavşanın akciğerlerini kalple birlikte bir petri kabının üzerindeki steril bir gazlı bezin üzerine yerleştirin.
2. Atelektaziyi önlemek için, 2 cmH₂O'da ayarlanmış pozitif ekspiratuar son basınç (PEEP) ile pozitif basınçlı ventilasyon kullanarak akciğerleri havalandırın.
3. Ventrikülleri, atriyoventriküler oluk seviyesinde kalpten keserek çıkarın.
4. İki ventrikülü açtıktan sonra, tavşan için OD 4.6 mm pulmoner arter kanülünü pulmoner arterden bir sepet ile tanıtın ve tavşan için OD 5.9 mm sol atriyum kanülünü sepet ile mitral kapaktan sol atriyuma yerleştirin.
5. Kanülleri sabitlemek için pulmoner arter ve sol atriyumda 4-0 ipek sütür kullanın. Bu yapıların gerilmesini önlemek için çevredeki dokuları pulmoner arter ve sol atriyumun ligatürlerine dahil edin.
6. Vasküler yataktan kalan kanı temizlemek için arteriyel kanüllerden 250 mL salin izotonik solüsyon enjekte edin.

2. Perfüzyon tekniği:

1. Kurulum:
   1. İzole edilmiş akciğerleri dikkatlice akciğer odasına yerleştirin.
   2. Trakeayı haznenin kapağındaki transdüktöre takın.
   3. Kanüllü damarları perfüzyon sistemine bağlayın.
   4. Hazneyi kapatın ve döner kilitle sabitleyin.
      not: Devridaim perfüzyon devresi, açık bir venöz rezervuar, bir peristaltik pompa, bir ısı eşanjörü ve bir kabarcık kapanından oluşur.
   5. Bu noktada, hazne kapağını takın ve pozitiften negatif basınçlı ventilasyona geçmek için bir vanayı kapatın. Akciğerlerin negatif basınçlı ventilasyonunu ve haznenin hava geçirmez şekilde kapatılmasını kontrol etmek için, manometre üzerindeki akciğerin ve hazne basıncının solunum yolunu kontrol edin.
   6. Akciğerleri 200 mL yapay kansız perfüzat (sığır albümininin% 2.5'ini içeren bir Krebs-Ringer bikarbonat tamponu) ile perfüze edin.
   7. Perfüzat akışını 3 mL / dak / kg'da başlatın, ardından akışı 5 dakikalık bir süre boyunca yavaşça 5 mL / dak / kg'a yükseltin. Önümüzdeki 5 dakika içinde 8 mL / dak / kg'lık bir akışa ulaşın ve ardından 5 dakikalık bir süre sonra maksimum 10 mL / dak / kg'lık bir akışa ulaşın. Devreye hava girmesini önlemeye dikkat edin.
      not: Perfüzatın pH'ını ve sıcaklığını fizyolojik aralıklar içinde tutun (pH 7.4-7.5; sıcaklık, 37 °C-38 °C). PH'ı ayarlamak için NaHCO₃ (1N) ekleyin veya karbondioksit akışını artırın. Alternatif olarak, asitleştirmek için HCl (0.1N) kullanın.
2. Parametre:
   1. Önceden belirlenmiş perfüzyon ve ventilasyon parametrelerinin gerektiği gibi ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin.
   2. Akciğerleri 30 bpm frekansında, 10 mL / kg tidal hacimde ve 2 cmH₂O.
      ekspirasyon sonu basıncında (Pe) nemlendirilmiş hava ile havalandırın not: Pulmoner arter basıncı (0-20 mmHg), oksijenatör veya rezervuardaki sıvı seviyesinin pulmoner gövdenin santimetre cinsinden yüksekliğine karşılık gelirken, pulmoner venöz basınç, sol atriyumun üzerindeki basınç dengeleme odasının yüksekliğine karşılık gelir. Her iki değer de değiştirilebilir. Sol atriyum basıncının da 0-20 mmHg olduğunu unutmayın.
3. Bölge 3 koşullarına ulaşmak:
   1. Arteriyel (Pa) ve venöz (Pv) basınçları ölçmek için pulmoner arter, sol atriyum ve basınç transdüserlerinde sabitlenmiş kanüllerin yan portlarına bağlı iki kateteri kullanın.
   2. Temel basınçları akciğer hilumu seviyesine ayarlayın (Sıfır referans).
   3. Deneyleri bölge 3 havalandırma koşulları altında gerçekleştirin. Bunu başarmak için, izogravimetrik bir durumla karakterize edilen bir denge elde etmek için 10-15 dakika bekleyin.
   4. Bölge 3 koşullarının oluşması için venöz basıncın alveolar basınçtan (Palv) daha yüksek olduğundan ve arteriyel basıncın her ikisinden de (Pa > Pv > Palv) daha yüksek kaldığından emin olun.
   5. Deney sırasında maksimum sayıda pulmoner damar açmak ve mikrovasküler yatak içeriğini korumak için bölge 3 koşullarına ulaşmak için akciğerlerin ağırlığının sabit kaldığından ve arteriyel ve sol atriyal basınçların stabil olduğundan emin olun.
      not: Pulmoner ödemin bir göstergesi olarak Kfc ölçümü, manuel ve otomatik perfüzyon sistemi arasında bir değişiklik göstermez.
4. Elektronik kontrol ve sinyal işleme: Diğerlerinin yanı sıra solunum akışının, ağırlık değişikliklerinin, mikrovasküler basıncın, gelgit hacminin, vasküler direncin, dönüştürücülerden gelen sinyalleri entegre eden ve bunları değerlendirme sisteminde görüntüleyen çoklu bir merkezi elektronik ünitesine kaydedildiğinden emin olun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2 Stop'lu Tygon E-Lab Hortum, 3,17 mm İç Çap, 12/paket, Siyah/Beyaz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
IPL-4'te pozitif basınçlı ventilasyon için adaptör	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4'te pozitif basınçlı ventilasyon için adaptör	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4 için Alternatif Basınçsız Gaz Beslemesi: Negatif havalandırma sırasında trakeaya oda havasından farklı bir gaz karışımı sağlamak için	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Tavşandan fetal domuza izole edilmiş perfüze akciğere temel ünite	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Sığır serumu A2: D41albümin liyofilize toz	Sigma	3912	500 gr
Kalsiyum klorür, CaCl2·2H2O.	JT Fırıncı	10035-04-8
Kriyojenik şişeler	Corning	430659	2 mL
D-glikoz, C6H12O6.	Sigma	G5767
Diferansiyel Düşük Basınç Dönüştürücü DLP2.5, Aralık +- 2,5 cmH2O, HSE Konnektör	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Diferansiyel Basınç Dönüştürücü MPX, Aralık +- 100 cmH2O, HSE Konnektörü	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tüpleri
Etanol mutlak HPLC sınıfı	Kaledon
Şahin tüpleri			14 mL
Harvard Peristaltik Pompa P-230 (Kontrol Kutusu ve P-230 Motor Sürücüsü ile birlikte)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Isıtmalı Lineer Pnömotakometre 0 ila 10 L/dk akış aralığı	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Tek Pnömotakometre 230 VAC, 50 Hz için Isıtıcı Kontrol Cihazı	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	Pisa		5000 Kullanıcı Arayüzü
HPLC Kolonu (C18 100A 5U)	Tüm Teknolojiler	98121213	150 mm x 4,6 mm
Hidrofilik Şırınga Filtresi	Millex Tekstil	SLLGR04NL	4 mm
İzole Tavşandan Fetal Domuz Akciğerine IPL-4 Çekirdek Sistemi, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
İzole Tavşandan Fetal Domuz Akciğerine IPL-4 Çekirdek Sistemi, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Tampon Çözelti için Ceketli Cam Rezervuar, Frit ve Borulu, 6,0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda termostatik sirkülatör, tip E-103, 230 V/50 Hz, 3 L banyo hacmi, sıcaklık aralığı 20 ila 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Sepetli Tavşan için Sol Atriyum Kanülü, Dış Çap 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
PLUGSYS Modülü için Düşük Aralıklı Kan Basıncı Dönüştürücü P75	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4·7H2O	JT Fırıncı	10034-99-8
Mikrosantrifüj Tüpü	Corning	430909
IPL-4 için Basınç Regülatörlü Negatif Basınçlı Ventilasyon Kontrol Seçeneği	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
Yeni Zelanda tavşanları
PISABENTAL (Pentobarbital sodyum)	Pisa	Q-7833-215
PLUGSYS Kılıf, Tip 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Zaman Sayacı Modülü	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Dönüştürücü Amplifikatör Modülü (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Dönüştürücü Amplifikatör Modülü (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Basınç Regülatörlü Ventilasyon Kontrol Modülü	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potasyum klorür, KCl.	JT Fırıncı	3040-01
Potasyum dihidrojen fosfat, KH2PO4	JT Fırıncı	7778-77-0
Sepetli Tavşan için Pulmoner Arter Kanülü, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Perfüzyon için Servo Kontrolör (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpü	Yardımcı yıldız	3620	1.7 mL
Sodyum bikarbonat, NaHCO3	Sigma	S6014 Serisi
Sodyum klorür, NaCl.	Sigma	S9888 Serisi
Cerrahi eldivenler No. 7 1/2
Cerrahi eldivenler No. 8
Taygon tüpleri	Usta Tekstil
Tavşan için Trakeal Kanül, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163

Serisi kalınlığındadır Serisi adet