IPE ve RPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Tavşan Gözünden Oküler Pigment Epitel Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Bascuas, T., et al. Viral Olmayan Gen Terapisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, bir tavşan modelinden oküler pigment epitel hücreleri elde etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Hücreler, retinal dejeneratif hastalıklar için terapötik stratejiler geliştirmede yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Yeni Zelanda beyaz tavşanları, intraperitoneal enjekte edilen% 0.9 NaCl içinde seyreltilmiş aşırı dozda Pentobarbital (150 mg / kg) ile ötenazi yapıldı ve kurban edildikten hemen sonra gözlere enükleasyon yapıldı.

1. Hazırlıktan önce

1. Tam besiyerini hazırlayın (% 10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U / mL penisilin / 80 μg / mL streptomisin ve 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş DMEM / Ham F12). Ortayı, 1x PBS'yi ve% 0.25 tripsini (gerekirse) 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. Aseptik bir çalışma yeri hazırlamak için davlumbazın içine steril bir örtü koyun. Gerekli tüm steril aletleri ve malzemeleri davlumbazın içine yerleştirin.
   not: Sadece gözlerin enükleasyonu ve kalan kas dokusunun ve derinin temizlenmesi kaputun dışında yapılan işlemlerdir, geri kalan adımlar başlığın içinde yapılmalıdır.

2. Tavşan PE hücrelerinin izolasyonu

1. Hayvana ötenazi yaptıktan sonra gözleri enüklee etmek için kavisli makas ve Colibri forseps kullanın. Makas ve forseps (steril olmayan) kullanarak gözlerden kalan kas dokusunu ve cildi temizleyin.
   not: Gözlerin enükleasyonu ve temizlenmesi için kullanılan makas ve forsepslerin boyutu türe bağlıdır (örneğin, sıçan ve fare için aletler domuz ve sığırlar için kullanılanlardan daha küçük olacaktır) (bkz. Şekil 1).
   1. Gözleri steril olmayan PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın. İyot bazlı solüsyona 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, ardından steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
2. Ampulün açılması
   1. Bir gözünüzü steril bir gazlı bez üzerine koyun, sıkıştırın ve optik sinire sıkıca yakın tutun. Neşter #11 ile gözü açın ve limbusun yaklaşık 2 mm altına makas koyun. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.
3. IPE hücrelerinin izolasyonu
   1. Lensi çıkarın ve ince forsepslerle IPE hücrelerini içeren irisi nazikçe dışarı çekin. İrisi bir Petri kabına koyun, steril PBS ile yıkayın ve daha fazla iris hazırlanana kadar PBS'de bırakın. Bir neşter #10 ile keserek siliyer gövdeyi iristen çıkarın.
   2. 2 irisin hazırlanmasından sonra, 1 mL% 0.25 tripsin ile 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin; bu süre zarfında, RPE hücreleri izole edilebilir (bkz. adım 2.4). Tripsini çıkarın ve irise 1 mL tam ortam ekleyin ve düz ateşte parlatılmış Pasteur pipeti ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücreleri pipetleyerek dikkatlice yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için tripan mavisi ile 1: 3 oranında seyreltin.
   3. Hemen transfekte edilmezse, 24 oyuklu bir plakada (100.000 hücre /^cm2) 200.000 hücre / kuyuyu 1 mL tam ortamda (% 10 FBS) tohumlayın (tohumlama için bakınız Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, %5 CO2.
      'de kültürleyin not: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.
4. RPE hücrelerinin izolasyonu
   1. İnce forseps ile vitreus mizahını ve retinayı arka segmentten çıkarın. Retina pigment epiteline zarar vermekten kaçının.
   2. Steril bir gazlı bezi 12 oyuklu bir plakaya koyun ve ampulü gazlı bezin üzerine koyun.
   3. PBS ile yıkayın. Göz başına 50 μL %0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Tripsini çıkarın ve küre başına 150 μL tam ortam ekleyin ve RPE hücrelerini kavisli ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile hassas bir şekilde kazıyın; Dokuyu hareketsiz hale getirmek için ince forseps kullanın. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe koyun. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın; Neubauer odasındaki hücreleri saymak için tripan mavisi ile 1:4 oranında seyreltin.
   4. Hücreleri 10 dakika 120 x g'da santrifüjleyin.
   5. Hemen transfekte edilmezse, 24 oyuklu bir plakada (100.000 hücre /^cm2) 200.000 hücre / kuyuyu 1 mL tam ortamda (% 10 FBS) tohumlayın (tohumlama için bakınız Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, %5 CO2.
      'de kültürleyin not: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.

Sonuçlar

tür	Tripsin tedavisi	N° IPE hücreleri	N° RPE hücreleri	Tohumlama plakası (100.000 hücre/cm2)
tavşan	evet	~350.000	~2.500.000	24 oyuklu plakalar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 oyuklu plakalar	Corning	353043
24 oyuklu plakalar	Corning	353047
Betadin	Mundipharma (İlaç
Bonn mikro forseps düz
Kolibri forseps (steril)
DMEM/Jambon'un F12'si	Sigma-Aldrich	D8062
Örtü (steril)	Mölnlycke Sağlık Hizmetleri	800530
FBS (FBS)	Brunschwig	P40-37500 Serisi
Forseps (farklı boy) (steril)
Gazlı bez kompres	PROMEDİKAL AG	25403
NaCl (% 0.9)	Laboratoryum Dr. Bichsel AG	1000090
Neubauer odası	Marienfeld-üstün	640010
Pasteur pipeti (ateş cilası)	Witeg (Türkçe)	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penisilin / Streptomisin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Tiyopental İnresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri kabı	ThermoFisher Bilimsel	150288
Eşarp No. 10	Kuğu-Morton	501
Eşarp No. 11	Kuğu-Morton	503
Keskin-keskin uçlu kavisli Ekstra İnce Bonn Makas (steril)
Keskin-keskin uçlu düz Ekstra İnce Bonn Makas (steril)
Tripsin% 0.25	ThermoFisher Bilimsel	25050014
Vannas yaylı makas kavisli (steril)

Tedavisi) Gazetesi Serisi Belediyesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi