IPE ve RPE Hücrelerinin İzolasyonu: İzole Domuz Gözünden Pigmente Epitel Hücreleri Elde Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Bascuas T. ve diğerleri, Viral Olmayan Gen Terapisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, in vivo ve ex vivo çalışmalar için birincil kültürlerini elde etmek üzere domuz gözlerinden iris ve retina pigment epitel hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklıyoruz. Bu pigment hücreleri, oküler bozuklukları tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımları incelemek için genetik olarak değiştirilebilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlıktan önce

1. Tam besiyerini hazırlayın (% 10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U / mL penisilin / 80 μg / mL streptomisin ve 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş DMEM / Ham F12). Ortayı, 1x PBS'yi ve% 0.25 tripsini (gerekirse) 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. Aseptik bir çalışma yeri hazırlamak için davlumbazın içine steril bir örtü koyun. Gerekli tüm steril aletleri ve malzemeleri davlumbazın içine yerleştirin.
   NOT: Sadece gözlerin enükleasyonu ve kalan kas dokusunun ve derinin temizlenmesi kaputun dışında yapılan işlemlerdir, geri kalan adımlar başlığın içinde yapılmalıdır.
3. Domuz gözleri, kurban edildikten sonraki 6 saat içinde yerel bir mezbahadan alındı ve buz üzerinde laboratuvara taşındı

2. Domuz PE hücrelerinin izolasyonu

1. Hayvana ötenazi yaptıktan sonra gözleri enüklee etmek için kavisli makas ve Colibri forseps kullanın. Makas ve forseps (steril olmayan) kullanarak gözlerden kalan kas dokusunu ve cildi temizleyin.
   not: Gözlerin enükleasyonu ve temizlenmesi için kullanılan makas ve forsepslerin boyutu türe bağlıdır (örneğin, sıçan ve fare için aletler domuz ve sığırlar için kullanılanlardan daha küçük olacaktır) (bkz. Şekil 1).
   1. Gözleri steril olmayan PBS ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın. İyot bazlı solüsyona 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, ardından steril PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
   2. Gözleri steril bir Petri kabına aktardıktan sonra, Colibri veya sivri forseps ile optik sinire sıkıca yakın tutun. 18 G'lik bir iğne ile iris sınırına yakın bir yerde (pars plana ve ora serrata arasında) bir delik açın. Deliğe küçük bir makas sokun ve irisin etrafını kesin. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.

3. IPE hücrelerinin izolasyonu

1. Bir neşter #10 ile keserek siliyer gövdeyi iristen çıkarın. 2 irisin hazırlanmasından sonra, 1 mL tam ortam ekleyin ve düz ateşte parlatılmış Pasteur pipeti ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için tripan mavisi ile 1: 4 oranında seyreltin.
2. Hemen transfekte edilmezse, 24 oyuklu bir plakada (100.000 hücre /^cm2) 200.000 hücre / kuyuyu 1 mL tam ortamda (% 10 FBS) tohumlayın (tohumlama için bakınız Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, %5 CO₂.
   'de kültürleyin not: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.

4. RPE hücrelerinin izolasyonu

1. Adım 1.1.1'i gerçekleştirin. Ampulü bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile yıkayın. Ampulü 1 mL tam ortamla doldurun.
2. Kavisli, ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti kullanarak RPE hücrelerini dikkatlice çıkarın. Koroid-Bruch zar kompleksinin aşağı kaymasını önlemek için aşağıdan yukarıya doğru kazıdığınızdan emin olun. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak ampul içindeki hücre süspansiyonunu toplayın ve yeniden süspansiyon için 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için tripan mavisi ile 1:8 oranında seyreltin.
3. Adım 3.2'de açıklandığı gibi tohum hücreleri.

Sonuçlar

tür	Tripsin tedavisi	N° IPE hücreleri	N° RPE hücreleri	Tohumlama plakası (100.000 hücre/cm2)
domuz	Hayır	~1.000.000	~3.000.000	24 oyuklu plakalar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 oyuklu plakalar	Corning	353043
24 oyuklu plakalar	Corning	353047
Betadin	Mundipharma (İlaç
Bonn mikro forseps düz
Kolibri forseps (steril)
DMEM/Jambon'un F12'si	Sigma-Aldrich	D8062
FBS (FBS)	Brunschwig	P40-37500 Serisi
Forseps (farklı boyutlarda) (steril)
NaCl (% 0.9)	Laboratoryum Dr. Bichsel AG	1000090
İğne (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neubauer odası	Marienfeld-üstün	640010
Pasteur pipeti (ateş cilası)	Witeg (Türkçe)	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penisilin / Streptomisin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Petri kabı	ThermoFisher Bilimsel	150288
Eşarp No. 10	Kuğu-Morton	501
Eşarp No. 11	Kuğu-Morton	503
Keskin-keskin uçlu kavisli Ekstra İnce Bonn Makas (steril)
Keskin-keskin uçlu düz Ekstra İnce Bonn Makas (steril)
Tali Görüntü Tabanlı Sitometre	ThermoFisher Bilimsel	T10796
Tripsin% 0.25	ThermoFisher Bilimsel	25050014
Tripsin %5 / EDTA %2	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas yaylı makas kavisli (steril)

Tedavisi) Gazetesi Serisi Belediyesi Belediyesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi