Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Bir aşının hazırlanması
- 10 mL LB suyunu köpük tıpa ile 50 mL konik bir şişeye dökün.
- Bir P. aeruginosa suşu PAO1 veya suşu PA14 kolonisini taze bir agar plakasından aktarın ve bakteriler orta log fazına gelene kadar 37 ° C'de 3-4 saat inkübe edin.
- Bakteri kültürünü 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini PBS'de yeniden askıya alın.
- Hücreleri yıkamak için adım 1.3'ü iki kez daha tekrarlayın. Hücre peletini PBS'de yeniden süspanse edin ve steril PBS'yi boş olarak kullanarak 600 nm'de optik yoğunluğu yaklaşık 0.6'ya ayarlayın.
2. Korneoskleral düğmeyi enfekte etmek
- Ortamı Petri kabından çıkarın ve korneaları 1 mL steril PBS ile iki kez durulayın.
- Korneayı arada tutarken forsepsleri hafifçe sıkın. Korneoskleral düğmenin orta bölümünde epitel tabakasından alttaki stroma'ya kadar iki dikey, iki yatay olmak üzere dört kesim yapmak için 10A'lık bir neşter kullanın.
- Steril bir cam kalıbı geniş kısmı yukarı bakacak şekilde 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve korneayı cam kalıbın ortasına, epitel tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Kesimi cam kalıbın alt kısmının tam ortasından yapın.
- KRİTİK ADIM: Cam kalıbı kornea ile tamamen doldurmak için DMEM içinde çözülmüş 1 mL %1 (a/h) düşük erime noktalı agar dökün.
- Agarın sertleşmesine izin verin ve ardından cam kalıbı kornea epiteli yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
- OD600nm = 0.6 (P. aeruginosa için bu, 15 μL'de yaklaşık 1 x 107 koloni oluşturan birime (CFU) eşittir) ile bakteri kültürünün 15 μL'sini doğrudan bir kesim alanına pipetleyin ve ardından kornea epitelini nemli tutmak için üstüne 85 μL PBS ekleyin. Aşı için koloni oluşturan birimleri saymak için kalan bakteri kültürünü ve plakayı agar üzerinde seyreltin.
- Cam kalıp ile her kuyucuğun dibine antibiyotiksiz 1 mL DMEM ekleyin. 6 oyuklu plakayı, enfekte korneoskleral düğmelerle nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saate kadar inkübe edin.
- Her deneyin yanında enfekte olmamış kontrol korneasını ayarlayın. Enfekte olmayan kontrolü ayarlamak için, adım 2.6'daki 15 μL bakteri kültürünü steril PBS ile değiştirin.
