Ex vivo Domuz Akciğer Biyofilm Modeli: Domuz Bronşiolar Dokusu Üzerinde Bakteriyel Biyofilmleri İncelemek İçin Akciğer Modeli Geliştirme Tekniği

Özet

Kaynak: Harrington, N.E. ve ark., Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biyofilmlerinin Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinlik Testi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, enfekte bronşiolar doku üzerinde ex vivo domuz akciğeri bakteriyel biyofilm modeli geliştirme protokolü açıklanmaktadır. Biyofilmler, bir yüzeye yapışık bir matris içine gömülü bakteri agregalarıdır. Bu model, biyofilm oluşumunun farklı aşamalarında bakterilerin antibiyotik duyarlılığını incelemek için kullanılır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Ex vivo domuz akciğer (EVPL) dokusunun diseksiyonu ve enfeksiyonu

1. EVPL dokusu ile kullanım için SCFM yapın, Tablo 1'de verilen 1 L modifiye SCFM tarifini izleyin.
2. Diseksiyondan önce, P. aeruginosa/S. aureus için laboratuvarda standart olan herhangi bir agar kullanarak enfeksiyon için gerekli bakteri suşunun / suşlarının bir agar plakasını / plakalarını hazırlayın (ör., lizojeni suyu +% 1.2 agar).
3. Enfekte olmamış kontrol dokusu parçaları da dahil olmak üzere deney için kaç tane domuz bronşiolar doku parçasının gerekli olduğunu hesaplayın. Sonuçların tekrarlanabilirliğini doğrulamak için deneyi iki kopya akciğerde tekrarlamak için bu sayıyı iki ile çarpın.
4. 400 μL/doku parçası için yeterli besiyeri oluşturmak üzere agaroz pedleri yapmak için gereken SCFM agaroz (mL) hacmini belirlemek için gereken toplam doku parçası sayısını 0,5 ile çarpın ve ayrıca hazırlama sırasında herhangi bir pipetleme hatasını veya buharlaşmayı hesaba katmak için yedek SCFM agarını belirleyin.
5. İstenen toplam SCFM hacmini %0.8 ağırlık/hacim agaroz ile yapmak için gereken her 15 mL SCFM'ye 0.12 g agaroz ekleyin.
6. SCFM agaroz solüsyonunu agaroz tamamen eriyene kadar ısıtın. Düşük güçte ev tipi bir mikrodalga fırın önerilir. Gereken süre, mikrodalga fırının watt değerine bağlıdır. Agarozun yaklaşık 50 °C'ye kadar soğumasına izin verin (dokunulduğunda sıcak, ancak tutması rahat). Daha fazla soğumasına izin vermeyin.
7. Bir pipet kullanarak, gereken doku parçası başına 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 400 μL SCFM agaroz ekleyin.
8. SCFM agaroz içeren 24 oyuklu plakayı/plakaları ultraviyole ışık altında 10 dakika sterilize edin.
9. 20 mL steril Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) artı 50 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 20 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kullanılarak diseke edilen her sağlam akciğer için üç tekrar yıkama hazırlayın.
10. Diseke edilen her sağlam akciğer için son yıkama olarak 40 mL SCFM'lik bir alikot yapın. Tüm yıkamalar gece boyunca 4 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.
11. Kesimden sonra mümkün olan en kısa sürede belirlenen kaynaktan akciğerleri alın ve ev tipi bir soğutma kutusunda laboratuvara taşıyarak soğuk tutulmalarını sağlayın.
    not: Kesim gününe daha yakın akciğerler depolamadan daha az morarma gösterir, ancak kesimden itibaren 4 güne kadar soğuk hava deposunda tutulan dokular da kullanılabilir. Soğutma kutusunun kasap dükkanına veya mezbahaya götürülmesi gerektiğinden, kontaminasyon riskini ve muhafaza ihlali riskini azaltmak için her kullanımdan sonra yerel laboratuvar yönergelerine göre dekontamine edilmeli ve kullanılmadığında mikrobiyoloji laboratuvarının dışında saklanmalıdır.
12. Sterilize edilmiş bir yüzey üzerinde ve alev altında çalışarak, akciğerleri otoklavlanmış alüminyum folyo ile kaplı temiz bir plastik doğrama tahtası üzerine yerleştirin. Bronşiyollerin sağlam kaldığını kontrol edin. Mezbahada veya taşıma sırasında herhangi bir hasar meydana gelmişse, akciğerler kullanıma uygun değildir.
13. Bir palet bıçağını alev altında ısıtın ve dokunun yüzeyini sterilize etmek için bıçağı bronşitolü çevreleyen akciğer bölgesine çok kısa bir süre dokundurun.
14. Steril monte edilmiş bir tıraş bıçağı kullanarak bronşitolü çevreleyen yüzey dokusunu kesin. Herhangi bir hasarı önlemek için bronşiyola paralel kesiler yapın.
15. Bronşiyol açığa çıktıktan sonra, bronşiolü serbest bırakmak için görünür en yüksek noktada bronşiyol boyunca kesitsel bir kesi yapın.
16. Steril forseps kullanarak, bronşiolün serbest ucunu hafifçe tutun ve steril monte edilmiş bir tıraş bıçağı kullanarak kalan istenmeyen dokuları kesin. Bronşitolü akciğerlerden çıkarmak için herhangi bir dallanma görünmeden önce bronşiyol boyunca son bir kesitsel kesi yapın.
17. Bronşiyolu ilk DMEM / RPMI 1640 yıkamasına yerleştirin. Bronşiolü yıkamada bırakın ve planlanan deney için yeterli doku kesiti elde etmek için aynı akciğerden gerektiği gibi ek bronşiyol bölümleri toplamak için 1.12 ila 1.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
18. Aynı akciğerden herhangi bir ek bronşiolar bölümü yıkamaya yerleştirin (adım 1.17). En az 2 dakika yıkamada bırakın.
19. Bronşiyolleri ilk DMEM / RPMI 1640 yıkamasından çıkarın ve numuneleri steril bir Petri kabına yerleştirin.
20. Dokuya zarar vermemeye dikkat ederek steril forseps kullanarak her bronşitolü hafifçe tutun. Mümkün olduğu kadar çok kalan yumuşak dokuyu çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak dokuyu ~ 5 mm genişliğinde şeritler halinde kesin.
21. Tüm bronşiolar doku şeritlerini ikinci DMEM / RPMI 1640 yıkamasına yerleştirin. En az 2 dakika yıkamada bırakın.
22. Dokuya zarar vermemeye dikkat ederek steril forseps kullanarak doku şeritlerini ikinci yıkamadan çıkarın. Dokuyu temiz, steril bir Petri kabına yerleştirin.
23. Bronşiole bağlı kalan yumuşak dokuyu çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak şeritleri kareler halinde (~ 5 mm x 5 mm) kesin.
24. Üçüncü DMEM/RPMI 1640 yıkamasını Petri kabına ekleyin. Tabak etrafında döndürerek doku parçalarını yıkamada hafifçe karıştırın.
25. Doku parçalarını çıkarmadan üçüncü yıkamayı Petri kabından dökün.
26. Son SCFM yıkamasını doku içeren Petri kabına ekleyin ve tüm doku parçalarının kaplandığından emin olun.
27. Doku parçalarını SCFM'de UV ışığı altında 5 dakika sterilize edin.
28. Her sterilize edilmiş bronşiolar doku parçasını, SCFM agaroz pedleri içeren 24 oyuklu bir plakanın / s'nin ayrı oyuklarına aktarmak için steril forseps kullanın.
29. Her bir doku parçasını istenen bakteri suşu ile enfekte etmek için, steril 0.5 mL'lik bir insülin şırıngasına bağlı 29 G'lık bir iğnenin ucu ile bir agar plakası üzerinde büyütülen bir koloniye dokunun. Daha sonra koloniyi doku parçasına dokundurun ve doku yüzeyini nazikçe delin.
    not: 29 G iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanmak, parmakları hem iğneden hem de akciğer dokusundan güvenli bir mesafede tutarken iğnenin doğru ve rahat bir şekilde tutulmasını sağlar. Bu adımı bir şırıngaya bağlı olmayan 29 G'lik iğneler kullanarak gerçekleştirmek mümkündür, ancak bu daha fazla el becerisi gerektirir ve iğne batması yaralanması riskini artırır. İnsülin şırıngaları kolayca temin edilebilir.
30. Enfekte olmamış kontroller için, steril 0.5 mL insülin şırıngasına bağlı 29 G'lik bir iğnenin ucuyla doku parçalarının her birinin yüzeyini nazikçe delin.
31. Her oyuğa 500 μL SCFM eklemek için bir pipet kullanın.
32. Ultraviyole ışık altında 10 dakika boyunca her 24 oyuklu plaka için nefes alabilen bir sızdırmazlık membranını sterilize edin (Malzeme Tablosu).
33. Kapakları 24 oyuklu plakadan/plakalardan çıkarın ve nefes alabilen membran ile değiştirin.
34. Plakaları 37 °C'de istenen inkübasyon (enfeksiyon) süresi boyunca çalkalamadan inkübe edin. Enfekte olmamış kontrol parçalarında aşılanmış patojenin gözle görülür bir şekilde büyümesi olmadığını kontrol edin (kontaminasyon kontrolü).
    not: İstenirse, SCFM agaroz pedlerine ampisilin eklenebilir ve SCFM'yi adım 1.31'de 20 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar kaplayabilir. Bu, P. aeruginosa veya S. aureus büyümesini etkilemeden akciğerlerdeki çoğu endojen bakterinin büyümesini baskılayacaktır, ancak ampisilin varlığı diğer antibiyotiklere duyarlılığı etkileyebileceğinden, okuyucu bu seçimi yapmak için bırakılmıştır.

>TABLO 1

1. Ex vivo domuz akciğer modeli ile kullanım için Sentetik CF Balgam Besiyerinin (SCFM) hazırlanması

SCFM bir kez yapıldıktan sonra filtreyle sterilize edilmeli ve daha sonra 4°C'de bir aya kadar saklanmalıdır.

Serisi

a) Ana tarif
Adım 1	kimyasal	miktar	Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	NaCl (Doğal)	3.03 gr	Yalnızca SCFM'nin hazırlanması için kullanılan temiz şişeye tuz ve su ekleyin	51,85
	Kartal	1.114 gr		14,94
	dH2O	640 ml		Yok
Adım 2	kimyasal	Suda yapılan, filtreyle sterilize edilen ve 4°C'de saklanan stok molaritesi	Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	Na2HPO4	0,125 milyon	1. adımda hazırlanan tuzlara ve suya her stoktan 10 ml ekleyin	1,25
	NaH2PO4	0,13 milyon		Saat 1,30
	NH4Cl	0,228 milyon		2,28
	KNO3	0,0348 milyon		0,35
	K2SO4	0,0271 milyon		0,27
	Moplar	1 AYLIK		Saat 10.00
Adım 3	kimyasal		Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	19 amino asit çözeltileri Bölüm B'ye göre hazırlanmış)		Adım 1 ve 2'de hazırlanan çözeltiye her stoktan 10 ml ekleyin.	Bkz. bölüm b)
Adım 4	Kimyasal		Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	HCl veya gerektiği gibi NaOH		1-3 ila 6.8 adımlarında hazırlanan çözeltinin pH'ını ayarlamak için kullanın. Rekor hacimde asit/baz eklendi.	Yok
Adım 5	Kimyasal		Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	dH2O		1-4. adımlarda hazırlanan çözeltiye, 960 ml'lik son hacme ekleyin	Yok
Adım 6	kimyasal	Suda yapılan, filtreyle sterilize edilen ve 4°C'de saklanan stok molaritesi	Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	CaCl2	0,175 milyon	1-5. adımlarda hazırlanan çözeltiye her stoktan 10 ml ekleyin	1,75
	MgCl2	0,0606 milyon		0,61
Adım 7	kimyasal	Suda yapılan, filtreyle sterilize edilen ve 4°C'de saklanan stok molaritesi	Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	L-Laktik asit	0,93 milyon	5M NaOH ile pH 7'ye kadar su stoku yapın. 1-6 adımlarında hazırlanan çözeltiye 10 ml ekleyin.	9.30
Adım 8	kimyasal	Tarife eklenmeden hemen önce suda yapılan çalışma stoğunun molaritesi	Talimat -ları	1L SCFM'de son mM
	Fe(III)SO4.7H2O	0,00036 milyon	Çözelti çökeltiden uzak kaldığı sürece filtreyle sterilize edilebilen ve 4°C'de saklanabilen 0,036 M'lik bir ana stok yapın. Çalışma stoğunu yapmak için, 110 μl ana stoğu 9.890 ml dH2O'ya ekleyin ve çalışma stoğunu 1-7. adımlarda hazırlanan çözeltiye ekleyin.	0,0036

adet adet adet adet adet adet adet

b) Amino asit stoklarının hazırlanması; kullanmadan önce süzgeçten geçirerek sterilize edin ve 4°C'de saklayın.
amino asit	mM stoğu	Talimat -ları	1 L SCFM'de son mM
Alanin	178	Suda çözünür	1.780
arginin	30,6	Suda çözünür	0,306
Aspartat	82,7	0,5 M NaOH içinde çözün	0,827
Sistein	16	Suda çözünür	0,160
Glutamik Asit	154,9	1 m HCl'de çözün	1.549
glisin	120,3	Suda çözünür	1.203
histidin	51,9	Suda çözünür	0,519
İzolösin	112.1	Bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca 50 ° C'ye ısıtarak suda çözün	1.121
Lösin	160,9	Suda çözünür	1.609
lizin	212,8	Suda çözünür	2.128
Metiyonin	63,3	Suda çözünür	0,633
Ornitin-HCl	67,6	Suda çözünür	0,676
Fenilalanin	53	Suda çözünür	0,530
Prolin	166	Suda çözünür	1.660
Serin	144,6	Suda çözünür	1.446
Treonin	107,2	Suda çözünür	1.072
Triptofan	1.3	0.2 M NaOH içinde çözün	0,013
Tirozin	80,2	1M NaOH içinde çözün	0,802
Valin	111,7	Suda çözünür	1.117

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsülin şırıngaları - 29G iğne takılı 0.5 mL.	VWR (VWR)	BDAM324892
24 oyuklu kültür plakaları
Diseksiyon ekipmanının yüzey sterilizasyonu ve alevlenmesi için% 70 etanol veya benzeri
P. aeruginosa/S. aureus (herhangi bir uygun ortam) çizgilerini hazırlamak için agar plakaları
agaroz
Alüminyum folyo - otoklavlama ile önceden sterilize edilmiştir - akciğerleri inceleyeceğiniz doğrama tahtasını kaplamak için.
Çok kuyulu plakalar için Breathe-easy veya Breathe-easy-daha kolay sızdırmazlık membranı	Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji	BEM-1 veya BERM-2000
Bunsen brülör
Doğrama tahtası - alkolle kolay dekontaminasyon sağlamak için plastik bir tahta öneririz.
Akciğerleri laboratuvara taşımak için coolbox
Farklı boyutlarda diseksiyon makası
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM)
Büyük palet bıçağı
Monte edilmiş tıraş bıçakları
Petri kapları
Steril ve temizlenebilir bir diseksiyon yüzeyi oluşturmak için plastik doğrama tahtası ve alüminyum folyo
Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta
Scfm			Tablo 1'de listelenen malzemeler
Forseps seçimi (künt uçlar önerilir)
Kurumunuzun göre kontamine kesici aletlerin ve domuz akciğer dokusunun atılması için uygun kaplar Sağlık ve Güvenlik Politikaları.