Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Organ kültürü kaplarında ön segmentlerin ayarlanması
- Tek bir ön segmenti (AS), AS ters çevrilmiş (fincan yukarı) bir Petri kabına yerleştirin. Pamuklu bir bez kullanarak, ortamı ıslatın ve herhangi bir pigmenti çıkarmak için korneanın ortasına hafifçe vurun. Gözü tutmak için forseps ve aynı çubuğu kullanarak, fazla pigmenti çıkarmak için pamuklu çubuğu skleranın etrafına silin.
- AS'yi ters çevirin ve korneayı tabaktaki yükseltilmiş bölgenin üzerine ortalayarak, tabağın alt kısmının üstüne yerleştirin. cl'yi yerleştirinamphalkası yeni yerleştirilen AS'nin üzerine.
- Halkayı, AS halkanın altında olacak şekilde yerinde tutmak için ilgili deliklere dört vida yerleştirin. L tuşu ile vidaları nazikçe elle sıkın.
not: Sıkma adımı, deney boyunca günlük olarak gerçekleşecektir, bu nedenle buradaki ilk sıkma işleminin amacı, sıkıştırma halkasının kırılmasını önlerken ortamın sızmamasını sağlamaktır.
- Steril bir Petri kabı seti ile üst kısmı tabağın üzerine yerleştirin ve kurulumu ters çevirin. Bulaşık standını takın. O-ringli akışkan konektörleri çanağın altındaki dişli bağlantı noktalarına takın.
- Bir akışkan konektöre 18 G 90° bükülmüş bir iğne göbeği, bir uzunlukta boru, 18 G iğne göbeği, bir naylon şırınga filtresi, üç bir valf ve ortamla doldurulmuş 20 mL'lik bir şırınga takın.
- İkinci akışkan konektöre, 18 G 90 ° derece bükülmüş bir iğne göbeği, boru uzunluğu, 18 G iğne göbeği, üç bir valf ve steril 10 mL'lik bir şırınganın namlu kısmını takın (bu, sıvıyı yakalamak için bir rezervuar görevi görecektir. ASOC'tan gelen sıvı ve kabarcıklar).
- Üç valfler şırıngalara uygun şekilde açıkken, AS'yi şişirmek, borudaki ortamı doldurmak ve son olarak rezervuarı doldurmak için adım 1.5'te tanımlanan akışkan konektör bağlantı noktasını kullanarak ortamı sistemden nazikçe itin.
not: ASOC kabına ortam sızarsa, AS, sıkıştırma halkası ile yeterince sıkı bir şekilde sabitlenmemiştir.
- Ortamı tabağa nazikçe iterek ve baloncukları hazneye itmek için tabağı ters çevirerek kabarcıkları çıkarın.
- Çanağı yerleştirin ve dik durun. Bir Petri kabının alt kısmını, boruyu sıkıştırmamaya dikkat ederek standın ayaklarının altına yerleştirin.
2. Ön segment organ kültürüne başlama
- ASOC artık kuluçka için hazırdır. ASOC kabını hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin (37 °C, %5 CO2). Göz içi basıncını (GİB) doğru bir şekilde hesaplamak için inkübatördeki ASOC kabının basınç transdüserlerinin üzerindeki yüksekliğinin bilindiğinden ve hesaba katıldığından emin olun.
- Boru hatlarını, kapının açılıp kapanmasına müdahale etmeyecek şekilde 37 °C, %5CO2 inkübatör kapısının altından dışarı doğru yönlendirin. 20 mL'lik şırıngayı 2.5 μL/dk'ya ayarlanmış şırınga pompasına takın.
- Boru hattını rezervuar ile birlikte basınç dönüştürücü cihazına yerleştirin. Boru hatlarına hava kabarcıklarının girmesini önlemek için PBS'yi hattan geçirirken yan 3 vanayı basınç dönüştürücü kurulumuna bağlayın.
not: Organ kültürü süresince mikrobiyal büyüme ile rezervuar kontaminasyonu olasılığını azaltmak için sistem kurulduktan sonra PBS'yi rezervuarlardan boşaltın.
- Önce veri dosyalarını kaydetmek için bir microSD kartın mevcut olduğundan emin olarak IOP veri toplamayı başlatın. Ardından, veri toplamaya başlamak için basınç dönüştürücü kurulumunu açın.
3. ASOC'un günlük bakımı
- ASOC'un dengelemek için 24 saati geçtikten sonra, bulaşıkları 37 °C, %5CO2 inkübatörden çıkarın ve Biyogüvenlik kabini (BSC) II kabinine yerleştirin.
not: Basınç verilerinin toplanmasında, ASOC'ler inkübatörden çıkarılırken (yükseklik değişimi) ve kabin içinde ayarlanırken bu zaman periyotları ani artışlar gibi görünür.
- Petri plakasındaki her kabın altında sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Varsa, çanağın altında sıkı sıvı bağlantıları olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden sıkın. Sıkıştırma halkasındaki vidaları sıkmak için steril bir L tuşu kullanarak bulaşağın üst kısmında sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
not: AS sklera dokusu kalınlığı 24 saat sıkıştıracak ve azaltacaktır ve sıkıştırma halkasının sıkılması gerekecektir.
- Medyayı çanak kuyusundan aspire edin.
not: Trabeküler ağ örgüsü, ASOC'ye pompalanan ortamdan sıvıyı filtreliyor. Bu nedenle, ASOC çanağında kenarlar boyunca medya bulunacaktır.
- Sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için 1.7 ve 1.8 adımlarını tekrarlayın.
- Şırınga pompalarındaki şırıngaları yeniden doldurun, şırınga pompalarının çalıştığından emin olun ve ASOC'ye perfüzyon için valflerin hizalandığını onaylayın. ASOC kabını 37 °C, %5 CO2 inkübatöre geri koyun.
not: Optimal olarak, bu adımlar günlük olarak gerçekleştirilmelidir. Bununla birlikte, 20 mL'lik bir başlangıç hacminin, ASOC çanak kuyusu hacminin ve 2,5 μL/dk'lık bir pompa hızının kullanılması, sistemin birkaç gün boyunca rahatsız edilmeden çalışmasına izin vermek için yeterli olmalıdır.
