Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Domuz Kalp Dokusu Dilimleme
- Doku banyosunu vibratom üzerine kurun, doku banyosu soğutma ceketine buz ekleyin, ardından Tyrode solüsyonunu doku banyosuna ekleyin. Doku banyosu soğutma ceketinden erimiş buzun atılması için 1 L plastik kavanoz kurun. 1 L dilimleme Tyrode çözeltisi için 3 g / L 2,3-bütandion monoksit (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glikoz (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 1 M çözelti), 1.8 mM CaCl2 (1.8 mL 1 M çözelti), 1 L'ye kadar ddH2O. NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Ardından, çözeltiyi 1.000 mL, 0.22 μm, vakumlu filtre / depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Biyogüvenlik kabininin altında, domuz kalbini 1 L taze soğuk kardiyoplejik solüsyon içeren bir tepsiye aktarın. 1 L kardiyoplejik çözelti için 110 mM NaCl (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL 1 M çözelti), 16 mM KCl (1.19 g), 16 mM MgCl2 (3.25 g), 10 mM NaHCO3 (0.84 g), 1 U / mL heparin, 1 L'ye kadar ddH2O karıştırın. NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Ardından, çözeltiyi 1.000 mL, 0.22 μm, vakumlu filtre / depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın><.
not: Dilimleme günü kardiyopleji çözeltisine 1.000 U / L heparin ekleyin.
- Geri çekilebilir steril neşterler kullanarak sol ventrikülü izole etmek için kalbi inceleyin. Ardından, sol ventrikülü jilet dikdörtgen bıçaklarkullanarak her biri 1−2 cm3'lük bloklar halinde kesin. Dilimlemek için bir parça kullanın ve kalan parçaları 50 mL'lik bir tüpte daha sonra gerekirse kesmek üzere soğuk Tyrode solüsyonunda buz üzerinde tutun.
not: Elinizle dilimlemeden önce dokuya masaj yapın, özellikle de bu ikinci blok ise. Masaj, doğru kas lifi konfigürasyonunun geri kazanılmasına yardımcı olur ve kalp bloğundaki herhangi bir sertliği önler.
- Metal numune tutucuya 1-2 damla doku yapıştırıcısı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve yaklaşık 1cm2 yüzey alanına sahip %4'lük agar bloğundan bir parça yapıştırın.
- Agarın üzerine 1-2 damla doku yapıştırıcısı ekleyin.
- Kalp bloğunu, kardiyak epikard tarafı aşağı bakacak şekilde doku yapıştırıcısının üzerine yapıştırın ve mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Ardından, kalp bloğu ile doku tutucuyu vibratomun dilimleme banyosundaki konumuna aktarın.
- Oksijen tüpünü dilimleme banyosuna ve dilimleri toplamak için Tyrode solüsyonu ile doldurulmuş metal tepsiye (oksijenli Tyrode banyosu) takın. Ardından, kestikten sonra dilimleri toplamak için metal tepsiye 40 μm hücre süzgeci ekleyin.
- Dilimleme konumunun ayarlanması
- Vibratom çalıştırma yazılımını ve gösterge panelini kullanarak bıçağın/numunenin yüksekliğini ayarlayın. Yükseklik düğmesini seçin ve yüksekliği ayarlamak için ekrandaki talimatları izleyin. İdeal olarak, bıçağı dokunun üst kısmına yakın, ancak papiller kasların altında tutun ve dilimlemeden önce dokuyu ve bıçağı kaplayan sıvı olduğundan emin olun.
- İlerleme düğmesini seçerek dokuyu dilimlemeye nereden başlayacağınızı ayarlayın. Dilim düğmesine basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğmeyi kullanarak hızı artırın. Ardından, durdurmak için dilime tekrar basın ve işlemi devre dışı bırakmak için ilerletme düğmesine basın.
- Kesme parametrelerini ayarlayın: ilerleme hızı = 0,03 mm/sn, titreşim frekansı = 80 Hz ve yatay titreşim genliği = 2 mm. Ardından, dilim düğmesini seçerek dilimlemeye başlayın.
- Vibratomun dokunun sonuna ulaşana kadar, ancak numune tutucunun arka ucuna çarpmadan önce dilimlenmesine izin verin. Bu noktada, durdurmak için dilim tuşuna tekrar basın. Başlangıç konumuna geri dönmek için Geri Dön düğmesine basın.
- Titreşimli mikrotomun dilimleme işlemini 99 defaya kadar otomatik olarak tekrarlamasına izin verecek olan otomatik tekrarı seçin (iki kez tıklayarak).
- Dilim toplama
- Dilimler tam uzunlukta olana ve iyi görünene kadar bekleyin (papiller kas katmanlarını geçtikten sonra), ardından dilimleri toplamaya başlayın.
- Dokuyu banyodan nazikçe tutmak için soğuk Tyrode solüsyonu ile doldurulmuş plastik bir Pasteur pipeti kullanarak dilimleri toplayın. Gerekirse, doku hala bağlıysa, dilimi kalp bloğundan ayırmak için forseps ve yaylı makas kullanın.
- Dilimi oksijenli Tyrode banyosundaki bir hücre süzgecine aktarın (bkz. adım 1.7) ve dokunun hücre süzgeçlerinden biri üzerinde düz durmasını sağlamak için plastik Pasteur pipetindeki sıvıyı kullanın, ardından dokuyu aşağıda tutmak için üstüne metal bir rondela ekleyin.