Domuz Kümülüs Oosit Kompleksi İzolasyonu: İn Vitro Fertilizasyon için Domuz Yumurtalık Folikülünden Kümülüs Oosit Kompleksini İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Gorczyca, G. ve diğerleri, Domuz Oosit Kapsüllemesi için Proteolitik Olarak Bozulmuş Aljinat Hidrojelleri ve Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, kümülüs-oosit kompleksini veya COC'yi domuz yumurtalıklarından izole etme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilmiş bozulmamış COC, doğurganlık tedavileri geliştirmek için yardımcı üreme tekniği olan in vitro fertilizasyonu gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Domuz kümülüsü-oosit komplekslerinin izolasyonu

1. Yumurtalık foliküllerinin izolasyonu için materyal toplamak için, yerel bir mezbahada prepubertal solungaçlardan (yaklaşık 6-7 aylık, 70 ila 80 kg ağırlığında) domuz yumurtalıklarını çıkarın. Her deneyde kümülüs-oosit kompleksleri (COC'ler) izolasyonu için 10 hayvandan yaklaşık 20 domuz yumurtalığı seçin.
   not: Her yumurtalığın 3-5 folikül verdiğini varsayarsak, toplam folikül sayısı 60 ila 100 arasında değişir.
2. Yumurtalıkları% 1 antimikotik çözelti (AAS) içeren steril fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4; 38 ° C) içeren bir termos içine yerleştirin. Deney materyalinin 1 saat içinde laboratuvara taşındığından ve burada antibiyotik içeren steril PBS ile iki kez durulandığından emin olun.
3. Yumurtalıkları duruladıktan sonra, bunları işleme ortamı (HM) (Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş behere aktarın ve tüm manipülasyonlar süresince 38 ° C'de bir inkübatörde saklayın.
   not: Oosit kullanımı sırasında en iyi sonuçları elde etmek için, tüm prosedürleri %2,5 antibiyotik/AAS ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ilavesiyle DMEM/F12 ortamında (işleme ortamı, HM) gerçekleştirin ve pH'ı ortamdaki CO₂ seviyesinde, sıcaklık kontrollü bir ısıtma masasında (38 °C) ve bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için laminer akış başlığının altında kontrol edin.
4. Büyük domuz foliküllerinden (6-8 mm çapında) foliküler sıvıyı (FF) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 100 x g'da aspirasyon ve santrifüjleme ile toplayın. Bundan sonra, 0.2 μm membran gözenekli filtrelere bağlı steril bir şırınga kullanarak süpernatanı filtreleyin ve -80 ° C'de dondurun.
   not: Foliküler sıvının aspirasyonu için bir insülin şırıngası (u-40) kullanın.
5. COC izolasyonu için sadece sağlıklı, orta büyüklükteki foliküllerin (4-6 mm çapında) seçildiğinden emin olun.
   not: Homojen ooplazma ve çok katmanlı (en az 3-4) kompakt kümülüs ile sağlam ve yuvarlak bir oosit içeren grade I COC'lerin daha ileri 3D IVM prosedürü için uygun olduğu düşünülmektedir.
6. COC'leri izole etmek için, 2-3 yumurtalığı HM ile doldurulmuş steril 10 cm çapında bir Petri kabına aktarın. Aşağıdaki prosedürlerden birini izleyerek COC'leri orta büyüklükteki foliküllerden izole edin.
   1. Çıkıntılı yumurtalık foliküllerinin yüzeyini steril bir cerrahi bıçak 15C ile nazikçe kesin. Bu, foliküler sıvının COC'lerle birlikte Petri kabına akmasına neden olacaktır.
   2. Tek kullanımlık bir şırıngaya bağlı 5/8" boyutunda 28 G iğne kullanarak foliküler içeriği aspire edin ve Petri kabına aktarın.
      not: Yumurtalık dokusu kalıntılarını atın. Sonraki izolasyon aşamaları bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir.
7. 3-5 adet 60 mm IVF Petri kabı hazırlayın.
   1. Merkezi kuyucuklara 1 mL HM ekleyin ve dış halkalarına 3-4 damla HM (damla başına 50 μL) yerleştirin.
   2. Ardından, bir polikarbonat mikropipet kullanarak, hasarsız COC'leri 3-4 kez kısa bir süre durulamak için dış halkalardaki HM damlalarına hareket ettirin.
   3. Sonunda, bunları ayrı ayrı merkezi kuyuya aktarın. Daha sonraki prosedürler için bu IVF plakalarını bir inkübatörde saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Genel
Antibiyotik Antimikotik (100x) 100ml	Termo Balıkçı	15240062	Taşıma Ortamı için %2,5 nihai konsantrasyon. PBS'de %1 (adım 1.2)
DMEM/F12 (500ml)	Sigma-Aldrich	D8062	Taşıma Ortamı
FCS (100 ml)	Termo Balıkçı	16140063	Taşıma Ortamı için %10 nihai konsantrasyon. (adım: 1.5)
PBS (1x, pH 7.4) 500ml	Termo Balıkçı	10010023
Olgunlaşma Ortamı
hCG (10 000 U'luk 1 ŞIŞE)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG (Parlak Çevre)	Biyo Satıcı	RP1782721000
Özel aletler, araçlar
30 mm Pteri çanak	TPP (Cesaret Partisi	93040
60 mm IVF Petri kabı	doğan	353653
kuvöz	Panasonic Belediyesi	MCO-170AIC-PE	Diğer markalar kullanılabilir
Steril petri kabı (10 cm)	NEST Biyoteknoloji	704002
termos	Keçuva dilleri	5602589	Diğer markalar kullanılabilir

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi