$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Süper hidrofobik florlu etilen propilen (FEP) mikrobiyoreaktörlerinde kapsülleme.
NOT: Tüm in vitro olgunlaşma (IVM) prosedürlerinin termostatik olarak kontrol edilen bir masa üzerinde gerçekleştirildiğinden ve kümülüs-oosit komplekslerinin (COC'ler) kullanımları boyunca 38 °C'de tutulduğundan emin olun.
- 5 g FEP toz yatağı içeren 30 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın - ortalama partikül boyutu 1 μm
NOT: Taze FEP tozu kullanmak önemlidir. Yeniden kullanılan FEP, toplanma ve kümeler oluşturma eğilimindedir.
- FEP tozunun yatağına 3-5 COC içeren tek bir olgunlaşma ortamı (MM) (~ 30 μL hacim) damlası dağıtın. Bu parçacıkların sıvı damlasının ve oluşan sıvı mermerlerin (LM) yüzeyini tamamen kapladığından emin olmak için plakayı dairesel hareketlerle hafifçe döndürün.
- 1.000 μL uçlu bir pipet kullanarak şekillendirilmiş LM'yi alın.
NOT: Pipet ucunu LM'nin çapına (4-5 mm) uyacak şekilde kenardan kesin. Böyle hazırlanmış bir ucun yaklaşık çapı, LM'ninkinden biraz daha büyük olmalıdır.
- Birkaç 60 mm in vitro fertilizasyon (IVF) Petri kabı hazırlayın. Nem odasını hazırlamak için dış halkalara 3-4 mL steril su ekleyin. Ardından, merkezi kuyuya bir LM yerleştirin.
NOT: Bu prosedür iyi bir el becerisi ve hassasiyet gerektirir - mermer dikkatsizce yerleştirilirse veya alçak bir yükseklikten bile düşerse, tahrip olur.
- Mermerleri %5 CO2 inkübatörde 38 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edin.
- Prosedürü takiben ortamı günlük olarak değiştirin: her LM'ye 30 μL MM uygulayın, bu da yayılmalarına neden olur çünkü doğrudan sıvı teması kaplanmış FEP tozlarının hidrofobikliğini bozar. Mermer içeriği çözüldüğünde, biyoreaktörden salınan COC'leri Petri kabındaki bir damla taze MM'ye aktarın.
NOT: Serbest kalan COC'leri hassas bir şekilde aktarmak için bir polikarbonat mikropipet kullanın.
- FEP partiküllerini çıkarmak için MM'de (3-4 kez) birkaç yıkamadan sonra, bunları 30 μL taze MM ile FEP toz yatağına aktarın. Toz parçacıklarının sıvı damlasının yüzeyini tamamen kaplamasını ve yeni bir LM oluşturmasını sağlamak için plakayı dairesel hareketlerle yavaşça döndürün.
- 1.000 μL uçlu bir pipet kullanarak şekillendirilmiş LM'yi alın.
- Nem odasını hazırlamak için dış halkalara 3-4 mL steril su ekleyin. Ardından, IVF Petri kabının merkezi kuyusuna bir LM yerleştirin.
NOT: FEP tozunun şeffaf kaplaması, bir ışık mikroskobu kullanılarak LM içeriğinin izlenmesine izin verir.