Domuz Kornea Endotel Hücrelerinin Lazer Destekli Seçici Ablasyonu: Ex Vivo Çalışmalar için Odaklanmış Domuz Kornea Endotel Hasarını İndüklemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Holzhey, A. et al., Kornea Endotel Hücre Kaybının İnvaziv Olmayan, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, domuz gözündeki kornea endotel hücrelerine seçici olarak zarar vermek için invaziv olmayan lazer destekli bir prosedürü göstermektedir. Geliştirilen ex vivo endotel hücre hasarı modeli, kornea endotel hastalıklarını incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Organ kültürünün hazırlanması ve lazer tedavisi

1. Yerel mezbahadan taze enükleasyonlu domuz gözleri edinin. Dulbecco'nun L-glutamin, sodyum piruvat, penisilin / streptomisin (% 1) ve domuz serumu (% 1) ile desteklenmiş yüksek glikozlu modifiye Eagle ortamında (DMEM) serin tutun (10 ° C), bundan böyle bu makalede tam ortam olarak anılacaktır.
2. Hücre dışı dokuları makasla çıkarın ve gözleri sterilize fosfat tamponlu salin (PBS) içine koymadan önce 5 dakika boyunca %5 povidon-iyot oftalmik solüsyonuna batırın.
3. Kornea yara izi, ödem ve diğer opaklıklar gibi önemli ön segment patolojileri için spektral alan optik koherens tomografi cihazı ile gözleri tarayın (Malzeme Tablosu).
4. Gözleri, havada 1,064 nm dalga boyuna ve 10 μm odak noktası çapına sahip Nd:YAG lazer (Malzeme Tablosu) ile donatılmış bir yarık lamba ünitesinin önüne yerleştirin.
   not: Optimum konumlandırma için, gözü çok fazla baskı uygulamadan sağlam tutmak için tasarlanmış 3D baskılı bir tutma aparatı kullanılır (Şekil 1).
5. 12x büyütme kullanın ve tek tek kornea katmanlarını görselleştirmek için aydınlatmayı saptırın.
6. Endotel hücrelerinin seçici ablasyonu için nabız enerjisini (örn. 1.6 mJ) ve odak noktasını (örn. 0.16 mm) ayarlayın.
7. Limbusa yakın şeffaf bir kornea parasentezi yerleştirin ve ön kamarayı stabilize etmek için viskoelastik (Malzeme Tablosu) enjekte edin.
8. Lazerle tedavi edilen merkezi korneayı 8 mm'lik bir trephine kullanarak eksize edin.
9. Eksize edilen korneayı, endotel bölgesi yukarı bakacak şekilde 12 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin ve numuneyi 3 güne kadar 37 ° C'de 3 mL tam ortamda inkübe edin.
   not: Bu adım sırasında ortama potansiyel sitoprotektif ajanlar eklenebilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Deney düzeneği.(A) Gözler, lazer ışınına göre hassas hizalamaya izin veren kısmen 3D baskılı bir tutma aparatına sabitlendi. (B) Lazer tedavisinden önce, majör ön segment patolojilerini kontrol etmek için doku ön segment optik koherens tomografi cihazı ile değerlendirildi. Odak lazer noktalarının konumları, 0,0 mm (siyah yıldız), 0,1 mm (kırmızı yıldız) ve 0,...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Barron vakumlu trephine	Katena	K20-2058
Kriyostat	Leica Belediyesi	CM 3050S Serisi
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium - yüksek glikoz	PAA (Türkçe)	E-15009
Göz tutucu	kendi	Yok
Ters Mikroskop	Leica Belediyesi	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd: YAG lazer	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II artı
OCT Doku Tek	Sakura İnce Teknik	4583
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333 Serisi
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Gibco (Gibco)	10010056
Domuz serumu	Sigma-Aldrich	12736C
Spektral alanlı optik koherens tomografi	Heidelberg Mühendislik	Spektralis
Doku kültürü plakası 12 oyuklu	Sarstedt	833921
Viskoelastik	Çok Yönlü Vizyon	Metotel

Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Belediyesi