Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanlar ve barınma
- 2-3 kg ağırlığında Yeni Zelanda Beyaz (NZW) tavşanları edinin.
- Tavşanları sıkı sıcaklık (65 ± 5 °F) ve nem (%45 ± %5) kontrolü olan kafeslerde tek başına barındırın. Aydınlatma 12 saatlik bir açma/kapama döngüsüne sahip olmalıdır.
- Suya ve standart tavşan yemeğine sınırsız erişim sağlayın. Gözü etkileyen A vitamini içerebilecekleri için diyet zenginleştirmelerini ortadan kaldırın.
- Başlangıç önlemlerinden veya kuru göz indüksiyonundan önce hayvanları en az 2 hafta boyunca alıştırın.
2. Anestezi ve ötenazi yöntemleri
NOT: Orta derecede sedasyon gerektiren Con A enjeksiyonu dışında tüm prosedürler hafif sedasyon gerektirir.
- Hafif sedasyon için, 26 gauge bir iğne kullanarak omuzların üzerine deri altına asepromazin (1 mg / kg) enjekte edin. Hafif sedasyon için son nokta: Hayvanlar, kulak lobları artık tamamen dik değilken rahat bir baş pozisyonunu korur.
not: Uygun son noktaya ulaşılmazsa, ek bir asepromazin enjeksiyonu yapılabilir. Hayvanlar her zaman uyanık kalmalı, bıyıklarına dokunmaya duyarlı olmalı ve asla yavaş nefes alma göstermemelidir.
- Orta derecede sedasyon için, önce hayvanlara yukarıdaki gibi asepromazin verin. Son noktaya ulaşıldıktan sonra (yukarıdaki nota bakın), O2 akışı 1 L / dk'ya ayarlanmış ve izofluran dağıtımı% 5'e ayarlanmış bir gaz maskesi kullanarak izofluran verin (Şekil 1).
- Tavşanın vücut tonusu tamamen gevşeyene ve kulakları tamamen sarkık olana kadar izofluran uygulayın.
not: Hayvan yan çevrildiğinde telafi edici kas hareketleri meydana gelmemelidir; Nefes almak her zaman kendiliğinden kalır.
- Spontan iyileşme 2-5 dakika içinde gerçekleşir: belirtiler spontan baş hareketlerini ve artmış veya normal kas tonusunu içerir. Deneysel prosedür orta derecede sedasyon ile tamamlandıktan sonra, tavşanları yaklaşık 30 dakika veya davranışları normale dönene kadar gözlemleyin.
not: Her iki sedasyon şekli sırasında da oftalmik merhem gerekli değildir. 1) Hafif sedasyonda, hayvanlar hala uyanıktır ve göz kırpma refleksini korur. Orta derecede sedasyonda, göz kırpma refleksinin inhibisyonu o kadar kısadır ki oküler yüzey risk altında değildir. 2) Oftalmik merhemin oküler yüzeye yerleştirilmesi, test sırasında değerlendirilen yapıların görselleştirilmesini engeller.
- Ötenazi: Aşırı dozda intravenöz pentobarbital (100 mg / kg) kullanın.
3. Kuru göz indüksiyonu ve tedavisi
NOT: Orbital lakrimal bez sisteminin üç kısmı enjekte edilir.
- Tavşanları deri altından 0.2 mg / kg asepromazin ile sakinleştirin.
- Periorbital ve kafa derisi bölgesindeki kürkü kesin ve Nair kullanarak kalan kürkü tamamen çıkarın. Anatomik işaretlerin daha iyi görselleştirilmesi ve US kılavuzluğunda concanavalin A enjeksiyonu için cildi tamamen pürüzsüz bırakın (Şekil 2).
- Yukarıda tarif edildiği gibi orta derecede sedasyon indükleyin.
- Superior lakrimal bezin palpebral kısmının enjeksiyonu (PSLG)
not: Önce PSLG enjeksiyonu yapın.
- Uygun göze 25 μL koruyucu içermeyen lidokain% 1 mikropipet ile uygulayın.
- Üst göz kapağını açın ve bezin palpebral kısmını işaretleyen çıkıntı görülene kadar arka orbital kenara hafif medial basınç uygulayın. PSLG, üst kapağın arka (temporal) kısmında küçük bir soğanlı yükseklik olarak görülür.
not: Öğrenme sürecinde bez dokusunu görüntülemek için bölgeye %5 floresein uygulayın (Şekil 3A). Soğanlı PSLG'den akan gözyaşları görülebilir. Con A'nın uygulanması için floresein uygulaması gerekli değildir; Sadece bez dokusunu göstermek için gösterim amaçlı yapılır.
- Bir tüberkülin şırıngası üzerinde ince dişli forseps ve 27 gauge iğne kullanarak, transkonjonktival bir yaklaşım kullanarak doğrudan beze nüfuz edin. İğneyi dokuya 2 mm ilerletin ve 0.1 mL'lik bir hacimde 500 μg Con A enjekte edin (Şekil 3B).
NOT: Bu enjeksiyon bazen ağrılı olabilir. Gerekirse, bu enjeksiyon tamamlanana kadar hayvanları izofluran altında tutun.
