Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Domuz Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyonu
- Aseptik koşullar altında, domuz aortunu yıkama tamponundan çıkarın ve 150 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1A).
- Aortun iki ucunu nazikçe kesin ve aort çevresindeki fazla dokuyu tekrar steril forseps ve makasla çıkarın (Şekil 1B). Aortun dışını ve içini (oda sıcaklığında kültür kabı üzerinde) 20−50 mL yıkama tamponu ile yıkayın: 1x PBS çözeltisi (pH 7.4)% 1 (h/h) Penisilin/Streptomisin.
not: Ameliyat sırasında sadece klemplerin yerleştirildiği bölgeyi kesmeye çalışın çünkü bu bölgede bazı EC'ler hasar görmüştür ve fazla dokuları ve arteriyel yan dalları çıkarın.
- Aorttan cerrahi bir dikiş geçirin ve ardından cerrahi sütürü kullanarak aortun bir ucunu bağlayın (5-0, 90cm, Malzeme Tablosu). Cerrahi ipliği aortun iç kısmında tutun (Şekil 1C,D).
- Aortu forseps ile bağlı uca yakın bir yere nazikçe sabitleyin ve ardından aortun endotel yüzeyi açığa çıkana kadar aortu tersine çevirmek için cerrahi dikişi yavaşça çekin (Şekil 1E−G).
not: Aortu bağlı uca yakın bir yere sabitlediğinizden emin olun ve aortu sıkıca sabitlemeyin, aksi takdirde cerrahi dikiş çekilerek aort geri döndürülemez.
- Aortun endotel yüzeyini 3x yıkama tamponu ile yıkayın (yıkama başına 10 mL) ve ardından bu solüsyonu atın. Aortu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve aortu tüpte 10 mL% 0.005 kollajenaz IV sindirim solüsyonu ile örtün (Şekil 1H).
not: %0.005 kollajenaz IV sindirim solüsyonunu sindirimden önce 37 °C'de önceden ısıtın.
- 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sindirilmiş aort ve sindirim solüsyonunu 100 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve 10−15 mL önceden soğutulmuş durdurma tamponu ekleyerek %0.005 kollajenaz IV'ün etkilerini durdurun: Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyeri (DMEM) %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve %1 P/S.
not: Önerilen sindirim süresi 10 ila 20 dakika arasındadır. Aortun endotel yüzeyinin durdurma tamponu ile kaplandığından emin olun.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak aortun iç yüzeyinden pAEC'leri nazikçe kazıyın (Şekil 1I). Kazınmış aortu 3x yıkama tamponu ile yıkayın (her seferinde 5 mL). Çözeltiyi kültür kabından 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Kültür kabının altını 2 kez yıkama tamponu ile yıkayın (her seferinde 5 mL) ve çözeltiyi tekrar 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun.
not: Nazikçe bir yönde kazıyın ve sıkıştırmayın. Kenarların ve deliklerin yakınındaki dokuya dokunmayın. 5−8x kazıma önerilir.
- Tüpü 600 x g'da 4 ° C'de 6 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün dibinde 10 mL çözelti bırakın. 50 mL santrifüj tüpüne 20 mL yıkama tamponu ekleyin ve peletleri yeniden süspanse edin. Bu adım sırasında baloncuklardan kaçının.
- 4 ° C'de 6 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça atın. Hücre peletlerini 1 mL kültür ortamı ile yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.
not: Cm aort başına elde edilen ortalama EC sayısı 1.9 x 10⁵ ± 1.4 x 10⁴'dir (ortalama ± SD, n = 3).
- Hücreleri bir hücre sayacı ile sayın. Hücre sayısına göre herhangi bir materyali kaplamadan hücreleri bir kapta plakalayın ve kültürleyin. Hücre sayısı 1.0 x 10⁶'ye eşit veya daha küçükse, hücreleri 25 cm²'lik bir şişede kültürleyin. Hücre sayısı 1.0 x 10⁶'den büyükse, birkaç 25 cm²'lik şişede (şişe başına 1.0 x 10⁶ hücre) kültür hücreleri. Şişeyi 37 °C'de %5 CO₂ içeren bir inkübatöre (çalkalamadan) yerleştirin ve ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.
not: Bazı hücreler hücre sıyırıcı tarafından zarar görür. Bir hücre canlılığı testi, canlı hücrelerin yüzdesinin %95.7 ± %1.7 olduğunu buldu (ortalama ± SD, n = 3). İzole edilen hücrelerin iki katına çıkma süresi yaklaşık 1-2 gündür.
