Kriyojenik Saman Kullanarak Tavşan Embriyosu Vitrifikasyonu: Tavşan Embriyolarını Uzun Süreli Depolama için Korumak İçin Ultra Hızlı Bir Soğutma Tekniği

Özet

Kaynak: Garcia-Dominguez, X. ve ark. Tavşan Modelinde Optimal Embriyo Aşamasında Minimal İnvaziv Embriyo Transferi ve Embriyo Vitrifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, kriyoprotektan olarak etilen glikol ve dimetil sülfoksit ve taşıyıcı sistem olarak kriyojenik saman kullanılarak istenen gelişim aşamasında hasat edilen tavşan embriyolarının vitrifikasyon prosedürünü anlatıyoruz. Vitrifiye embriyolar yüksek hayatta kalma oranına sahiptir ve kullanıma kadar uzun süre saklanabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Embriyo Vitrifikasyonu

1. Daha yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon çözeltisi toksisitesini azaltmak için tüm manipülasyonları oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) gerçekleştirin.
   not: Bu protokolde embriyolar 0.1–2 μL otomatik pipet kullanılarak hareket ettirilebilir, ancak embriyoları minimum hacimde sürükleyerek hareket ettirmek için diğer benzer cihazlar uygun olabilir.
2. Embriyoları iki aşamalı bir ekleme prosedüründe vitrifikasyon edin:
   1. Embriyoları, baz ortamında (BM) çözünmüş %10 (h/h) etilen glikol ve %10 (h/h) dimetil sülfoksitten oluşan dengeleyici solüsyona 2 dakika boyunca yerleştirin. (BM'nin Bileşimi: Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)% 0.2 (a / h) Sığır Serum Albümini ile desteklenmiş)
   2. Embriyoları (adım 1.2.1'den itibaren) 1 dakika boyunca BM'de çözünmüş %20 (h/h) etilen glikol ve %20 (h/h) dimetil sülfoksitten oluşan vitrifikasyon solüsyonuna taşıyın.
3. Embriyoları 0.25 mL'lik plastik bir mini pipete yükleyin (pamuklu bir tıkaçlı bir kapalı uç ve bir açık uç içerir). İşlem Şekil 1'de şematize edilmiştir.
   1. 0.25 mL mini pipetin kapalı ucunu uygun mikro dağıtıcı (örn. Captroll III)® ile birleştirin.
   2. BM'yi saman uzunluğunun 1 / 3'üne kadar aspire edin, ardından küçük bir hava kabarcığı uygulayın.
   3. Embriyoları 40 μL'lik bir vitrifikasyon çözeltisi hacminde aspire edin, ardından başka bir küçük hava kabarcığı izleyin.
   4. İlk sıvı fraksiyonu (adım 1.3.2) pamuğa ulaşana kadar BM'yi aspire edin.
   5. Açık ucu bir saman tapası ile kapatın.
4. Adım 1.2.2'yi adım 1.3 yapılırken gerçekleştirin ve embriyolar için toksik olabilecek bir dakikadan fazla geçmemesini sağlayın.
5. Vitrifikasyon elde etmek için mini pipeti doğrudan sıvı nitrojene daldırın.
6. Mini pipeti istenen süre boyunca nitrojen için bir dewarda saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Doğru yüklenmiş pipetin şematizasyonu. A) BM, vitrifikasyon sırasında kullanılan embriyo manipüle eden ortamı ifade eder. Embriyolar vitrifikasyon solüsyonuna yüklenmelidir. B) Embriyo pozisyonunun büyütülmüş bir detayı ile yüklü pipetin makroskopik görünümü. Bu büyük hacimli cihaz, minimum hacimli cihazlardan farklı olarak çok sayıda embriyoyu vitrifiye etmemizi sağlar. Ayr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA)	VWR (VWR)	332
Dimetil Sülfoksit	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773 Serisi	Kalsiyum klorür içermez.
Etilen Glikol	Sigma Aldrich	102466-M
Sıvı Azot	Hava Sıvısı,	P1505XXX
Plastik Pipet 0.25 mL	IMV - teknolojiler	6431
Stereomikroskop	Leica Belediyesi	MZ16F	Birkaç isim vermek gerekirse, Leica MZ8 veya Nikon SMZ-10 veya SMZ-2B gibi daha ucuz seçenekler var.
Saman Tapası	IMV - teknolojiler	6431