Yöntem makalesi

Tavşana Embriyo Transferi: Yumurtlayan Alıcı Dişi Tavşan Modelinin Yumurta Kanalına Laparoskopi Eşliğinde Embriyo Transferi İçin Bir Prosedür

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Garcia-Dominguez, X. et al., Tavşan Modelinde Optimal Embriyo Aşamasında Minimal İnvaziv Embriyo Transferi ve Embriyo Vitrifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, Laparoskopi yoluyla embriyoların alıcı dişi tavşanın yumurta kanalına aktarılması tekniği açıklanmaktadır. Yumurta kanalından geçişi sırasında tavşanlarda embriyonun yeniden şekillenmesine izin verir ve sonunda başarılı implantasyona yardımcı olur. Bu teknik, iyi bir verimlilikle saklanan embriyolar için de kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Embriyo Transferi

  1. Alıcı dişilerin hazırlanması
    1. Yalnızca cinsel olarak olgun kadınları kullanın (> 4,5 aylık).
    2. ET'den bir hafta önce, foliküler büyümeyi başlatmak ve kadın alıcılığını artırmak için dişileri 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık rejime uyarlayın.
    3. Vulvanın şişkinliğini ve rengini gözlemleyerek alıcı dişileri seçin. Vulva şişkin ve kırmızımsı ise, dişi alıcıdır.
    4. Vücut ağırlığından bağımsız olarak 1 μg buserelin asetat (Gonadotropin salgılayan hormonun sentetik analogu) tek bir kas içi enjeksiyonu ile yalancı gebeliği (yumurtlama) indükleyin.
      NOT: Normalde, 0.8 μg orta büyüklükteki tavşanlarda (4-5 kg) yumurtlama indüksiyonu için uygun bir dozdur, bu nedenle 1 μg genellikle yumurtlamayı garanti eder.
    5. Yumurtlamayı, transfer edilecek embriyoların yaşı kadar gün önce indükleyin (örneğin, taze morula ET'den 70-72 saat önce).
  2. Anestezi ve analjezi
    1. Tavşanı tartın ve aşağıdaki anestezikleri ve analjezikleri yükleyin.
      1. 30G iğneli 1 mL'lik bir şırıngada: ksilazin (5 mg / kg) ve buprenorfin hidroklorür (0.03 mg / kg) yükleyin. 23G perikraniyal iğneli başka bir 1 mL şırıngada ketamin hidroklorür (35 mg / kg) yükleyin.
    2. Tavşanı tutun ve ksilazin-buprenorfin karışımını kas içine enjekte edin.
    3. Ketamin içeren perikraniyal iğneyi marjinal kulak damarına yerleştirin ve tüm şırınga içeriğini intravenöz olarak yavaşça yerleştirin.
    4. İğneyi sabitleyin ve gerekirse daha fazla anestezi uygulamak için kalan adımlar boyunca takılı bırakın.
    5. Tavşanı kafeste (temiz ve başka hayvanlar olmadan) ılık bir sahnede bırakın.
    6. Bilincinizi kaybettikten sonra, gözün kurumasını önlemek için göz merhemi sürün ve palpebral frefleksin yokluğunu kontrol edin.
      not: Bu protokol en az 30 dakika süreyle cerrahi anestezi sağlar. Daha uzun bir süre gerekiyorsa, 30 dakika sonra 1.2.1'de açıklanan ketamin hidroklorür miktarının yarısı ile ek dozajlar enjekte edin.
    7. Pedal refleksini ve solunum hareketini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin. Solunum paternindeki düzensiz ve daha hızlı bir orandaki değişiklikler, uygun anestezi düzleminin kaybını gösterir.
    8. Mukoza zarının rengini (gözler, dudaklar vb.), solunum hızını (dakikada 30-60 nefes), kalp atış hızını (dakikada 120-325 atış) ve rektal sıcaklığı (38-39.6 °C) izleyin.
    9. Transferden sekiz saat önce, ET işlemi bitene kadar daha büyük bağırsak boyutu ve aktivitesini önlemek için hayvanlardan yiyecekleri alıkoyun. Suya ücretsiz erişim bırakın.
  3. Embriyo hazırlama
    1. Embriyo manipülasyon ortamını 25 ° C'ye ısıtın:% 0.2 (a / h) Sığır Serum Albümini ile desteklenmiş Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininden (DPBS) oluşan Baz Ortamı (BM).
    2. Stereomikroskop altında çalışarak, taze veya çözülmüş (Adım 2) embriyoları BM ile durulayın.
    3. Steril eldivenler kullanarak, uygun şekilde yapılandırılmış bir 17G epidural kateteri 1 mL'lik bir şırıngaya takın.
    4. Katetere 1 cm BM aspire edin, ardından küçük bir hava kabarcığı uygulayın.
    5. 10 μL BM'lik bir hacimde 5-7 embriyoyu aspire edin, ardından başka bir küçük hava kabarcığı izleyin.
    6. 1 cm BM aspire ederek kateteri yüklemeyi bitirin.
  4. Embriyo transferi
    1. Aseptik bir ortam sağlamak için steril eldiven, önlük ve maske kullanmayı düşünün.
    2. Cerrahi aletleri sterilize edin, ameliyatın yapılacağı yüzeyleri temizleyin ve %70 etanol ile silin.
    3. Anesteziyi daha önce detaylandırıldığı gibi uygulayın (adım 1.2), refleks kaybını kontrol edin.
    4. Ventral karın bölgesindeki kürkü elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin.
    5. Ventral karnı aseptik olarak hazırlayın.
      1. Cerrahi alanı temizleyin ve kalan tüyleri alın. Cerrahi alanı bir klorheksidin glukonat sabunu ile yıkayın. Alanı klorheksidin çözeltisi ve etanol 96º (3 kez) ile sterilize edin.
    6. Mide ve bağırsakların kafatası şeklinde yerleştirildiğinden emin olmak için hayvanı Trendelenburg pozisyonunda (baş aşağı 45°) ılık bir ameliyat masasına yerleştirin. Şişkin ise mesanenin tahliyesini düşünün. İşlem sırasında herhangi bir iç organ hasar görürse, hayvan ölebilir. Bu nedenle, bunların doğru şekilde yerleştirilmesi önemlidir (Şekil 1).
    7. Cerrahi bölgeyi olası kontamine edici alanlardan ayırmak için traş edilmiş alanı açığa çıkaran bir delik (fenestrasyon) ile steril bir havlu kullanarak alanı örtün.
    8. Karın boşluğuna 5 cm, ksifoid sürecine 2 cm kaudal bir endoskopik trokar yerleştirin ve içinden periton boşluğunu basınç düzenleyici bir mekanik insüflatör ile şişirin.
      not: Karın içi basıncı 8-12 mmHg ve CO2 olmalıdır (Şekil 1A).
    9. Endoskop kamerasını endoskopik trokarın içinden geçirin (Şekil 1B).
      NOT: Sonraki adımları kolaylaştırmak için ET'den önce infundibulum ve ampulla'nın durumunu ve konumunu belirleyerek üreme sistemini tanımlayın.
    10. 17-G epidural iğneyi infundibulumdan 2-3 cm uzaklıktaki inguinal bölgeye yerleştirin (Şekil 1B).
    11. İnfundibulumun girişini tanımlayın (Şekil 2A, 2B).
    12. Yüklü kateteri (adım 1.3) epidural iğneden karın içine yerleştirin (Şekil 1C).
    13. Yumurta kanalını bulun ve epidural kateterin 1-2 cm'lik kısmını ampulladaki infundibulumdan geçirin (Şekil 2A-2C). Hasarı ve kanamayı önlemek için yumurta kanalına çok fazla ilerlemeyin.
    14. Katetere bağlı şırınganın pistonuna hafifçe bastırarak embriyoları yumurta kanalına bırakın (Şekil 2D-2F). Her iki hava kabarcığı da kateterden çıkmalıdır.
    15. Embriyolar serbest bırakıldıktan hemen sonra kateteri çıkarın.
    16. Embriyoların yokluğunu kontrol etmek ve başarılı transferlerini onaylamak için kateteri durulayın, aspire edin ve manipüle edici ortamı serbest bırakın.
    17. İstenirse, uterusun diğer tarafında 1.4.11 ila 1.4.16 arasındaki adımları tekrarlayın.
    18. Epidural iğneyi ve endoskop kamerasını çıkarın.
    19. CO2'yi endoskopik trokardan serbest bırakın. Hayvanın karnında fazla gaz kalırsa, ağrı ve rahatsızlık hissedecektir.
    20. Endoskopik trokarı karın boşluğundan çıkarın. Cerrahi havluyu çıkarın.
    21. Anesteziyi bırakın.
    22. Trokar tarafından yapılan kesiği klorheksidin solüsyonu ile temizleyin. Trokarın yaptığı kesiyi mikronize alüminyum ve plastik bir pansuman ile kapatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Resim 1: Laparoskopi destekli laparoskopik embriyo transferi (Dıştan görünüm).A) Endoskopik trokarın yerleştirilmesi (bir port). B) Endoskopik kamera ve epidural iğnenin (siyah ok) yerleştirilmesi. C) Embriyo transfer kateterinin (beyaz ok) epidural iğneden geçirilmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA) VWR (VWR)332
Buprenorfin hidroklorürAlvet Escartí 626Lisanslı bir veteriner tarafından sipariş edilmeli.
Buserelin Asetat Sigma Aldrich B3303
CO2 Hava Sıvısı, 99921CO2 N48 olarak adlandırılır.
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) Sigma AldrichD5773 Serisi Kalsiyum klorür olmadan
Elektrikli tıraş makinesi Oster Altın A5 078005-140-002
Endoskop kamerası Optomic İspanya SaOP-714
Silikon yaprakçık valfli endoskop trokar Karl Storz Endoskopi Ibérica Sa30114GK Hafif trokar modeli.
Kloreksidin diglukonat sabunu Alvet Escartí0265DCCJ500B
Epicraneal iğne 23GAlvet Escartí514056353 Daha küçük iğneler de kullanılabilir.
Epidural kateter Vygon kurumsal187,1
Epidural iğne Vygon kurumsal187,1
Göz merhemi Alvet Escartí 5273
Laparoskopi ekipmanları Karl Storz Endoskopi Ibérica Sa 26003 AA Hopkins® Laparoskop, 0º mm düz görüşlü laparoskop, 30 cm uzunluk, 5 mm çalışma kanalı.
ışık kaynağı Optomic İspanya SaFibrolux 250
Mekanik CO2 insüflatörü Karl Storz Endoskopi Ibérica SaEndoflatör®
İnsuflato için silikon tüpr Karl Storz Endoskopi Ibérica S.A.20400040
Stereomikroskop Leica Belediyesi MZ16F Birkaç isim vermek gerekirse, Leica MZ8 veya Nikon SMZ-10 veya SMZ-2B gibi daha ucuz seçenekler var.
Tavşan Universitat Politècnica de València Satır ALine V veya Line HP gibi diğer maternal hatlar kullanılabilir.
· Serisi · Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ovidukt EnjeksiyonuEmbriyo mplantasyonuYalanc Gebelik nd ksiyonuEpidural KateterEndoskopik G r nt lemeOvidukt AmpullasEmbriyo Y kleme

İlgili makaleler