Yapışık Kültürlenmiş Hücrelere Nükleik Asitleri Sokmak için Boncuk Yükleme: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Yapışık Memeli Hücrelerine Yüklemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Cialek, C. A. et al. Boncuk Yükleme Proteinleri ve Nükleik Asitleri Yapışık İnsan Hücrelerine. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, boncuk yüklemesi kullanarak nükleik asitleri yapışık memeli hücrelerine sokma prosedürünü açıklıyoruz.

Protokol

>1. Boncuk yükleme hücreleri

NOT: Gerekirse, hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile kısa bir süre yıkayın ve ardından en uygun ortamdan 2 mL ekleyin. En az 30 dakika inkübe edin.

1. İstenilen plazmitleri, proteini ve/veya partikülleri içeren 3-8 μL'lik bir çözelti hazırlayın. Deneysel gereksinimlere bağlı olarak her bir plazmit tipinden ~ 1 μg (0.1-1 pmol) ve ~ 0.5 μg (0.01 nmol) protein kullanın. Proteinler için düşük retansiyonlu bir tüp kullanın, böylece tüp duvarlarında geride kalmazlar. Çözeltiyi PBS ile minimum 3 μL'ye getirin ve çözelti hacmini, yüklenecek hücrelerin tüm alanını kaplayacak şekilde ayarlayın (yani, odanın mikro kuyusu, Şekil 1B).
2. Tüpü yukarı ve aşağı pipetleyerek ve/veya fiske vurarak solüsyonu iyice karıştırın. Çözeltiyi bir masa üstü mikrofüjde tüpün dibine kadar kısaca döndürün.
3. Boncuk yükleme solüsyonunu ve hücre odasını bir doku kültürü başlığına aktarın. Steril teknik kullanarak doku kültürü başlığında kalan adımları gerçekleştirin.
4. Ortamı hücrelerden çıkarın ve geçici olarak steril bir tüpte saklayın. Tüm ortamı haznenin kenarlarından nazikçe aspire edin ve hazneyi yaklaşık 45°'lik bir açıyla eğin ve ortadaki mikro kuyuda kalan medya damlasını çıkarın. Orta çıkarma sırasında, pipet ucunun cama temas etmesine izin vermediğinizden emin olun, bu hücre soyulmasına ve kaybına neden olabilir. Hücrelerin uzun süre kuru kalmaması için hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.
5. Boncuk yükleme solüsyonunu haznenin ortasındaki cam mikro kuyuya nazikçe pipetleyin. İsteğe bağlı: Haznenin tamamen kurumasına izin vermeden ~ 30 s boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin.
6. Tercihen bir boncuk yükleme aparatı kullanarak, hücrelerin üzerine tek katmanlı bir cam boncuk yavaşça dağıtın (Şekil 1A). Boncukların cam tabanlı mikro kuyudaki hücreleri tamamen kapladığından emin olun.
7. Hazneyi iki parmağınızla sıkıştırarak, ~2 inç kaldırarak ve sıkıca aşağı indirerek kaput yüzeyine vurun. Çanağı bu yükseklikten düşürmeye yaklaşık olarak eşdeğer bir kuvvet kullanın. Toplam ~10 dokunuş için tekrarlayın.
   not: Muslukların hücreleri büyük ölçüde soymadığından emin olun. Kılavuz çekme, hücre tipi için optimize edilebilir. Hücreler yetersiz yüklenirse, daha sert vurun; Bununla birlikte, birçok hücre soyulursa, daha hafifçe vurun.
8. Haznenin plastik tarafına yavaşça pipetleyerek ortamı yavaşça hazneye geri ekleyin. Hücreleri rahatsız etmeden yüzen boncukları aspire etmeye çalışın. Çok fazla çıkarılmışsa, bu adımda daha fazla önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Hücreleri inkübatörde 0.5-2 saat inkübe edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Boncuk yükleme aparatı, tekniği ve zaman çizelgesi

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 cm hücre kültürü kapları	VWR (VWR)	82050-916	Hücreleri kültürlemek için kullanın
35 mm hücre kültürü kapları	doğan	353001	Boncuk yükleyici oluşturmak için kullanın
Attofluor Hücre Odası	Thermo Fisher Bilimsel	A7816	Özel boncuk yükleyiciyi oluşturmak için kullanın
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok	Thermo Fisher Bilimsel	11960069	Genel hücre kültüründe kullanım
Cam alt tabaklar, 35 mm, #1.5, 14 mm cam	MatTek Şirketi	P35G-1.5-14-C	Görüntüleme için hücreleri bu odacıklara tohumlayın
Cam boncuklar, asitle yıkanmış, ≤106 μm	Kırlangıç Sigma	G4649	Plazmid DNA ve proteinleri boncuk yüklemek için hücrelerin üzerine serpin
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Thermo Fisher Bilimsel	AM9625	Steril 1X PBS'nin çalışma stoğu
Fenol içermeyen DMEM	Thermo Fisher Bilimsel	31053036	Görüntülemeden önce hücrelerde kullanın
Opti-MEM, Azaltılmış Serum Ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	31985070	Boncuk yüklemeden önce hücreleri inkübe etmek için en uygun ortam (isteğe bağlı adım)

Serisi Serisi Serisi