Nükleik Asit Kargosunun Nanoblade Tabanlı Dağıtımı: Cas9-sgRNA Kompleksini Virüs Benzeri Parçacıklar Yoluyla Hedef Hücrelere Ulaştırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Mangeot, P. E., et al. Cas9/sgRNA Ribonükleoprotein Kompleksinin Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") Yoluyla Verilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, genom düzenleme için hedef hücrelerin içine Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksinin nanoblade tabanlı iletimi için bir tekniği göstermektedir. Nanoblade'ler, komşu hücreleri çoğaltma ve enfekte etme yeteneğinden yoksun virüs benzeri parçacıklardır, bu nedenle biyo ve nanomalzemelerin hızlı ve doza bağlı taşınması için çok faydalıdır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. sgRNA Tasarımı ve klonlama

NOT: sgRNA'ların tasarımı için yönergeler, https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing gibi birden fazla kaynaktan veya Hanna ve Doench'ten elde edilebilir.

1. 20 nükleotid sgRNA dizisi tasarlandıktan sonra, aşağıdaki tek sarmallı DNA oligonükleotidlerini sipariş edin:
   1. İleri: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
   Ters: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC
   2. 3' (N, PAM dizisi olmadan hedeflenen lokusun ters tamamlayıcısına karşılık gelir)
      not: Oligonükleotidleri sipariş ederken özel bir değişiklik gerekmez (5' fosfat gereksinimi yoktur).
2. 5 μL tavlama tamponu (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; 25 °C'de pH 7.9), her DNA oligonükleotidinden 1 μL (suda 100 μM stok çözeltisi) ve 42 μL suyu karıştırarak 0.2 mL'lik bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde iki DNA oligonükleotidini hibritleştirin.
3. Bir PCR bloğunda, numuneleri 95 °C'de 15 saniye inkübe edin ve ardından 20 °C/s'lik bir rampa ile sıcaklığı 0.5 °C'ye düşürün. Oda sıcaklığında saklayın veya -20 °C'de saklayın.
   not: Protokol buradan duraklatılabilir.
4. 10 μg BLADE veya SUPERBLADE sgRNA ekspresyon plazmitlerini 10 birim BsmBI-v2 kısıtlama enzimi ile 55 μC'de 3 saat boyunca toplam 50 μL.
   reaksiyon hacminde sindirin not: Sindirilmiş vektör, ~1.9 kb'lik bir DNA eki ve ~3.3 kb'lik ikinci bir DNA parçası bırakmalıdır.
5. Kısıtlama reaksiyonunu 5 μg/mL etidyum bromür (veya daha güvenli bir alternatif DNA jel boyası) ile boyanmış %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.
   not: Genetik kusurlara neden olduğundan şüphelenilen etidyum bromürü manipüle ederken uygun koruyucu giysiler giyin.
   1. 312 nm dalga boyuna ayarlanmış bir ultraviyole (UV) masasında (DNA'ya zarar vermemek için), 3.3 kb DNA parçasını jelden kesin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
      NOT: Etidyum bromürü manipüle ederken ve UV tablası üzerinde çalışırken uygun koruma donanımı (eldiven ve UV koruma gözlüğü) kullanın.
   2. Özel bir DNA jeli ekstraksiyon kiti kullanarak 3.3 kb DNA fragmanını içeren dilimlenmiş jelden DNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın). Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA miktarını ölçün.
      NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
Adım
6. 1.2'den hibritleştirilmiş ileri ve geri DNA oligonükleotidlerini adım 1.5.2'den BsmB1 ile sindirilmiş, jel ile saflaştırılmış BLADES veya SUPERBLADE vektörüne bağlayın. Bunun için 2 μL T4 DNA ligaz tamponu, 50 ng jel ile saflaştırılmış vektör (adım 1.5.2'den), 1 μL hibritleştirilmiş DNA oligonükleotid (adım 1.2'den), hacmi 19 μL'ye kadar oluşturmak için su ve 1 μL T4 DNA ligaz. Reaksiyonu 25 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
   1. Ligasyon ürününü yetkin bakterilere dönüştürün (Malzeme Tablosuna bakınız). Dönüştürülmüş bakterileri bir ampisilin Luria Bertani agar plakası üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. DNA mini hazırlığını gerçekleştirmek için agar plakası üzerinde birkaç izole koloni seçin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sgRNA değişken dizisinin doğru ligasyonunu kontrol etmek için bir U6 ileri primer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') kullanarak Sanger dizilemesi gerçekleştirin.
      NOT: Cas9 proteinini kodlamadıkları takdirde diğer sgRNA ekspresyon plazmitleri kullanılabilir, bu da Nanoblade üretimine müdahale edebilir.

2. Plazmid hazırlama

1. Gerekli tüm plazmitlerin maksipreparatını (Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirin ve -20 °C'de saklamak için 1 μg/mL'de 10 μg alikot hazırlayın. Plazmitlerin tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının; alikotları atmadan önce iki kez kullanın.

3. Nanoblade hazırlığı

1. 1. Günde, 3,5 ila 4 × 10 6 HEK293T hücre (Malzeme Tablosuna bakınız) arasında yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin içeren 10 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında. Hücreleri kültür kabı üzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için 10 cm'lik plakayı nazikçe ileri ve geri, ardından sağdan sola (bu diziyi 5 kez tekrarlayın) hareket ettirin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂.
   içeren bir hücre inkübatöründe inkübe edin not: Kültürlenmiş hücrelerin ve Nanoblade'lerin işlenmesiyle ilgili tüm prosedürler, kontaminasyonlarını önlemek için bir hücre kültürü laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmelidir.
2. 2. Gün: Plazmit transfeksiyonu
   1. Hücreler, kaplamadan 24 saat sonra% 70-80 oranında birleşik olmalıdır (Şekil 1A). Transfeksiyondan önce ortamı yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-glutamin,% 10 FBS (penisilin ve streptomisin zorunlu olmasa da atlanabilir) içeren 10 mL taze DMEM ile değiştirin.
      NOT: Bu adımda, hücrelerin birleşik olmaması önemlidir. Aksi takdirde, transfeksiyon verimliliği ve partikül üretimi azaltılabilir.
   2. Her 10 cm'lik plaka için 1,5 mL'lik bir tüpte aşağıdaki miktarlarda plazmit hazırlayın: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, klonlanmış sgRNA'yı kodlayan 4,4 μg BLADES veya SUPERBLADES plazmidi (veya iki sgRNA kullanılıyorsa her biri 2,2 μg).
   3. 500 μL transfeksiyon tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), 10 sn girdap yapın ve ardından 1 sn santrifüjleyin. 20 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın), tüpü 1 sn vorteksleyin ve ardından 1 sn santrifüjleyin.
   4. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve tüm çözeltiyi bir P1000 pipetleyici kullanarak DMEM ortamındaki hücrelere damla damla ekleyin. Transfeksiyon reaktifini hücreler üzerinde eşit şekilde dağıtmak için 10 cm'lik plakayı nazikçe ileri ve geri, ardından sağdan sola (bu diziyi 5x tekrarlayın) hareket ettirin. Hücreleri 37 ° C'de en az 40 saat boyunca% 5 CO₂.
      içeren bir hücre inkübatöründe inkübe edin not: İstenirse, transfeksiyondan 4 saat sonra ortam değiştirilebilir.
3. 3. Günde, transfekte edilmiş hücrelerin morfolojisini mikroskop altında kontrol edin.
   not: Üretici hücreler kaynaşmaya başlayacaktır. Bu, fsorojenik viral zarfların ekspresyonu nedeniyle normal bir durumdur (Şekil 1B,C).
4. 4. Gün: Nanoblades
   Hasat not: Transfeksiyondan en az 40 saat sonra, fsorojenik viral zarfların ekspresyonu nedeniyle hücreler birbirine kaynaşmış olacaktır ve bazen hücreler plaka desteğinden tamamen ayrılır (Şekil 1D).
   1. 10 mL'lik bir pipet kullanarak 9 mL kültür ortamı süpernatantı toplayın.
      not: Nanoblade'ler, Cas9 proteinini ve ilişkili sgRNA'yı birincil hücrelere ve in vivo olarak iletebilen VLP'lerdir. Genetik materyalden yoksun oldukları için genetik olarak değiştirilmiş organizmalar olarak kabul edilmeseler de, genetik değişikliklere neden olabilirler. Bu nedenle, kullanıcılarla herhangi bir temastan kaçınmak için dikkatli bir şekilde manipüle edilmeleri gerekir (özellikle tümör baskılayıcı genleri hedeflemek üzere programlanmışlarsa). Kullanıcılara, retroviral vektörlerin manipülasyonu için yerel güvenlik yönergelerine uymaları ve VLP'leri hazırlarken ve transdüksiyon deneyleri gerçekleştirirken BSL-2 düzeyinde bir laboratuvarda çalışmaları tavsiye edilir. Nanoblade'ler %70 etanol veya %0.5 sodyum hipoklorit ile inaktive edilebilir. Nanoblade'leri etkisiz hale getirmek için tüm plastik atıkların (pipet uçları, doku kültürü plakaları, santrifüj tüpleri) en az 10 dakika boyunca %0,5 sodyum hipoklorit ile işlenmesi de tavsiye edilir.
   2. Hücresel kalıntıları gidermek ve hücre peletini bozmadan süpernatanı geri kazanmak için toplanan süpernatanı 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Nanoblade'lerin birincil hücrelerde kullanılması amaçlanıyorsa, süpernatanı 0,45 μm veya 0,8 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin. Filtre membranında önemli bir kısım tıkanacağı için bu adımın Nanoblade titresini büyük ölçüde azalttığını unutmayın.
   3. Nanoblade'leri gece boyunca (12-16 saat) sallanan bir kova rotorunda 4.300 × g veya 209.490 × g'da bir ultrasantrifüjde 75 dakika boyunca 4 ° C'de peletleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Hedef hücreler DMEM'de büyüyebiliyorsa, Nanoblade'leri konsantre etmeden adım 3.4.2'den sonra elde edilen süpernatan ile doğrudan inkübe etmek mümkündür.
5. 5. Gün: Nanoblade'lerin yeniden askıya alınması ve depolanması
   1. Santrifüjlemeden sonra, ortamı yavaşça aspire edin ve beyaz peleti 100 μL soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden süspanse edin. Tüpü parafilm ile örtün ve peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse etmeden önce hafif çalkalama ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      not: Yeniden süspansiyon üzerine beyaz viskoz bir malzeme görünebilir; Bu normaldir ve iletim verimliliğini önemli ölçüde etkilemez.
   2. Dört hafta içinde kullanmayı planlıyorsanız Nanoblade'leri 4 °C'de saklayın. Aksi takdirde, Nanoblade'leri sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: Sıvı nitrojeni manipüle ederken koruyucu gözlük ve kriyojenik eldiven takın. Ani dondurma ve -80 °C'de depolama, Nanoblade verimliliğinde önemli bir düşüşe yol açar. Ayrıca, çözülmüş Nanoblade'ler tekrar dondurulmamalıdır. Protokol buradan duraklatılabilir.

4. Nanoblade'lerin sakaroz yastığı üzerinde konsantrasyonu

NOT: Gece santrifüjleme veya ultrasantrifüjlemeye (adım 3.4.3) alternatif olarak, Nanoblade'ler bir sükroz yastığı üzerinde konsantre edilebilir. Bu, Nanoblade'lerin daha saf bir kısmını verir, ancak geri kazanılan toplam miktar daha düşük olacaktır.

1. 1x PBS'de% 10'luk bir sükroz çözeltisi (ağırlıkça hacim) hazırlayın ve 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Nanoblade'leri sükroz yastığı üzerinde yoğunlaştırma işlemine başlayın.
   1. 9 mL VLP içeren numuneyi (adım 3.4.3'ten itibaren) bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). 3 mL'lik bir şırınga ve kanül kullanarak, VLP içeren numuneyi ve sükroz solüsyonunu karıştırmamaya çalışarak, numunenin altına %10'luk sükrozun 2,5 mL'sini yavaşça katman
   .
   2. Alternatif olarak, 2,5 mL% 10 sükrozu bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüpü eğin ve 9 mL VLP içeren numuneyi (adım 3.4.3'ten itibaren) düşük hızlı bir pipetleyici ile yavaşça ekleyin. Bu işlem sırasında, tüpü kademeli olarak dikey konuma kaldırın.
3. Numuneleri 209.490 × g'da bir ultrasantrifüjde 90 dakika boyunca 4 °C.
   'da santrifüjleyin not: Bu teknik, gece boyunca düşük hızlı santrifüjleme (4.300 × g) için uyarlanabilir.
4. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tüpü kağıt mendil üzerine baş aşağı yerleştirin. 1 dakika sonra, 100 μL 1x PBS ekleyin ve tüpü 4 °C'de, bir parafilm kapaklı olarak 1 saat boyunca bir çalkalama masasındaki bir tüp tutucusuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse etmeden önce.
   NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.

5. Nanoblade'lerde Cas9 yüklemesini dot-blot ile izleme

1. 4 hacim 1x PBS'ye iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içeren 1 hacim lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek seyreltme tamponunu hazırlayın. 2 μL konsantre Nanoblade'i 50 μL seyreltme tamponunda seyreltin, kısaca vorteksleyin ve bu karışımın 25 μL'sini 25 μL seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın. 4 tüp Nanoblade seyreltme (2 kat seyreltme adımları) elde etmek için bu işlemi tekrarlayın.
2. Standart kontroller için, 2 μL rekombinant Cas9 nükleazını (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 μL seyreltme tamponuna seyreltin, kısaca vorteksleyin ve sekiz seri seyreltme (her adım için 2 kat seyreltme) yapmaya devam edin.
3. Her VLP seyreltmesinin 2,5 μL'sini ve her standardın 2,5 μL'sini çok kanallı bir pipetle bir nitroselüloz membran üzerine dikkatlice yerleştirin (daha büyük bir hacim üst üste binen noktalara neden olabilir).
   not: Metanol ile muamele edilmiş bir polivinildiflorür membranı da kullanılabilir.
4. Parçacıklar zar üzerine emildikten sonra, zarı oda sıcaklığında 45 dakika boyunca yağsız kuru süt (%5 a/h) ile desteklenmiş iyonik olmayan bir yüzey aktif madde (TBS-T) içeren 1x Tris tamponlu tuzlu su ile bloke edin.
   not: Protokol burada duraklatılabilir ve membran 1x TBS-T'de 4 °C'de saklanabilir.
5. Yağsız kuru süt ile takviye edilmiş 1x TBST'yi atın ve zarı gece boyunca 4 ° C'de Cas9-yaban turpu peroksidaz antikoru (1x TBST'de 1/1000 seyreltme,% 5 süt) ile inkübe edin. Membranı 3x TBS-T ile yıkayın ve gelişmiş bir kemilüminesan substrat kiti kullanarak sinyali görselleştirin.
6. Jel görüntüleme istasyonu veya imageJ ile birlikte verilen özel yazılımı kullanarak Nanoblade'ler ve rekombinant Cas9 standart seyreltmeleri için nokta yoğunluğunu ölçün. Nokta yoğunluğunu Cas9 konsantrasyonuna bağlayan doğrusal bir eğri tanımlayın. Elde edilen eğrinin fonksiyonunu kullanarak, her hazırlıktaki Cas9 içeriğini tahmin edin.
   not: Rekombinant Cas9 protein kontrolünün miktarı, standart seyreltme setinin en konsantre numuneleri için okumayı doyurabilir (Şekil 2). Bu nedenle, doğrusal eğriyi tanımlarken, tespit edilen bilinen Cas9 konsantrasyonuna göre doğrusal aralıkta değillerse, seyreltilmemiş numunelerden (ve bazen ilk seyreltme adımlarından) okumanın çıkarılması tavsiye edilir. Benzer şekilde, Nanoblade numuneleri içindeki Cas9 miktarını tahmin ederken, yalnızca standart eğrinin doğrusal aralığı içindeki okumaları kullanın.

6. Hedef hücrelerin Nanoblades ile transdüksiyonu (12 oyuklu bir plakada transdüksiyon prosedürü)

1. 12 oyuklu bir plakada, uygun hücre kültürü ortamının 1 mL'sinde oyuk başına 100.000-200.000 hücre (birincil veya ölümsüzleştirilmiş yapışkan hücreler) tohumlayın. Transdüksiyondan önce hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasına izin verin.
2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 500 μL hücre kültürü ortamına 5-20 μL konsantre Nanoblade (adım 3.5.1 veya 4.4'ten itibaren) ekleyin ve bir P1000 pipetleyici ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Ortamı hücrelerden çıkarın ve bu Nanoblade karışımının 500 μL'si ile değiştirin.
   not: Transdüksiyon her hücre tipi için optimize edilmelidir. Nanoblade'lerin yüksek konsantrasyonda kalması için mümkün olan en küçük hacimde ortam kullanmak (hedef hücrelerin kurumasını önlerken) önemlidir. Yapışık hücreler, plakaya bağlıyken doğrudan transdüksiyon yapılmalıdır (transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde azaltacağından süspansiyon halinde transdüksiyon yapmayın). Bazı hücreler Nanoblade'lere (24-48 saat) uzun süre maruz kalmayı tolere ederken, diğerleri çok hassastır ve küçük sinsitya oluşturabilir. Bu durumda, Nanoblade'ler, ortamı değiştirmeden önce sadece 4-6 saat hücrelerle inkübe edilmelidir. Spinokülasyon ayrıca süspansiyon halinde büyüyen hücreler için transdüksiyonu da iyileştirebilir. Katyonik polimerler gibi adjuvanlar (Malzeme Tablosuna bakınız) bazı hücre tiplerinde transdüksiyon verimliliğini de artırabilir.
3. Nanoblades içeren düşük hacimli bir ortamda 4-6 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, ortamın hacmini normal miktara yükseltin (12 oyuklu bir plaka ile çalışıyorsanız 1 mL) veya hücreler VLP'lere duyarlıysa taze ortamla değiştirin.
   not: Nanoblades içeren hücre ortamı, atılmadan önce 10 dakika boyunca% 0.5 sodyum hipoklorit ile inaktive edilmelidir. Sodyum hipokloriti manipüle ederken eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. Nanoblade'ler hücre ölümüne neden olursa, hücre ölümünü azaltmak için maruz kalma miktarını ve toplam süresini uyarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Nanoblade üretimi sırasında üretici hücrelerin morfolojisi.(A) Kaplamadan 24 saat sonra% 70-80 birleşimde hücreleri HEK293T. (B ve C) Transfeksiyondan 24 saat sonra hücre morfolojisini HEK293T. (D) Transfeksiyondan 40 saat sonra hücre morfolojisini HEK293T. Ölçek çubukları = 400 μm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
13,2 mL, İnce Cibarlı Polipropilen Tüpler, 14 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	331372	Nanoblades saflaştırması için ultrasantrifüj tüpleri
Amersham Protran Premium Western kurutma membranları, nitroselüloz	Merck	GE10600004	Saflaştırılmış Nanoblade'ler içindeki Cas9 seviyelerini ölçmek için nitroselüloz membran
BIC-Gag-CAS9	Ekle	119942	Bir GAG (F-MLV)-CAS9(sp) füzyonunu kodlar. Aşırı eksprese edilmiş gRNA(lar) ve uygun zarflarla ilişkili olarak üretici hücrelerden GAG-CAS9 Virüsü benzeri partiküllerin üretilmesine izin verir
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Ekle	120922	Hedeflenen transkripsiyonel aktivasyon için bir GAG-dCAS9-VPR füzyonunu kodlar
Bıçak	Ekle	134912	Nanoblades sisteminde kullanılacak sgRNA dizisini klonlamak için boş omurga
BsmBI-v2	New England Biyolojik Laboratuvarları	R0739S Serisi	sgRNA klonlaması için BLADE ve SUPERBLADES vektörlerini sindirmek için kısıtlama enzimi
Cas9 (7A9-3A3) Fare mAb (HRP Eşleniği) #97982	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	97982S	Nokta-leke ile Cas9 kantifikasyonu için anti-Cas9 antikoru
Cas9 nükleaz, S. pyogenes	New England Biyolojik Laboratuvarları	M0386T Serisi	Rekombinant Cas9 proteini, Nanoblade'ler içinde yüklü Cas9 miktarının mutlak nicelleştirilmesi için referans olarak kullanılacaktır
Etidyum bromür çözeltisi (H2O içinde 10 mg/mL)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Agaroz jellerini boyamak ve DNA'yı görselleştirmek için
Fisherbrand Dalga Hareket Çalkalayıcılar	Balıkçı Bilimsel	88-861-028	Santrifüjleme sırasında Nanoblade'leri yeniden askıya almak için çalkalama masası
jel Analizörü			http://www.gelanalyzer.com sindirimden sonra bant yoğunluğunun ölçülmesi
Gesikül Üreticisi 293T	Takara	632617	Nanoblades üretici hücre hattı
Gibco DMEM, yüksek glikoz, piruvat	ThermoFisher Bilimsel	41966052	Gesicle Producer 293T hücreleri için hücre kültürü ortamı
DNA ve DNA/siRNA için jetPRIME Transfeksiyon Reaktif kiti	Çoklu artı	POL114-15	Gesicle Producer 293T hücrelerinde Nanoblade üretimi için transfeksiyon reaktifi
Millex-AA, 0,80 μm, şırınga filtresi	Kırlangıç	SLAA033SS	Nanoblade'lerin konsantrasyonundan önce hücresel kalıntıları gidermek için şırınga filtresi
Millex-GS, 0,22 μm, şırınga filtresi	Kırlangıç	SLGS033SS	Sükroz yastık solüsyonunu sterilize etmek için şırınga filtresi
Millex-HP, 0,45 μm, polietersülfon, şırınga filtresi	Kırlangıç	SLHP033RS	Nanoblades konsantrasyonundan önce hücresel kalıntıları gidermek için şırınga filtresi
Monarch DNA Jel Ekstraksiyon Kiti	New England Biyolojik Laboratuvarları	T1020L	BsmBI ile sindirim üzerine pBLADES veya pSUPERBLADES plazmit fragmanının saflaştırılması için DNA jeli ekstraksiyon kiti
NEB Kararlı Yetkin E. coli (Yüksek Verimlilik)	New England Biyolojik Laboratuvarları	C3040I (İngilizce)	Plazmit transformasyonu ve amplifikasyonu için yetkin bakteriler
Transfeksiyon dereceli plazmit DNA için NucleoBond Xtra Midi kiti	Macherey-Nagel	740410.5	Kültürlenmiş bakterilerden plazmit DNA'sının saflaştırılması için maksimize hazırlık kiti
Nucleospin gDNA ekstraksiyon kiti	Macherey-Nagel	740952.5	Transdüksiyonlu hücrelerden genomik DNA'nın ekstraksiyonu
NucleoSpin Plasmid, plazmit DNA için mini kit	Macherey-Nagel	740588.5	Kültürlenmiş bakterilerden plazmit DNA'sının saflaştırılması için mini hazırlık kiti
NucleoSpin Tissue, Hücrelerden ve dokudan DNA için Mini kit	Macherey-Nagel	740952.5	Genomik DNA ekstraksiyon kiti
Optima XE-90	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	A94471	Ultrasantrifüj
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Kişisel isteklerin şu adrese gönderilmesi gerekir: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Babun Endojen retrovirüs Girard-Gagnepain, A. ve ark. Babun zarf psödotipli LV'ler, erken sitokin ile uyarılan ve dinlenme halindeki HSC'lere gen transferi için VSV-G-LV'lerden daha iyi performans gösterir. Kan 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Ekle	35614	Murin Lösemi Virüsü, gag ve pol genlerini enkoder
pCMV-VSV-G	Ekle	8454	Lentiviral ve MuLV retroviral partikülleri üretmek için zarf proteini
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	ThermoFisher Bilimsel	14200091	Miligözenekli suda seyreltmek için 10X PBS
Polibren Transfeksiyon Reaktifi	Kırlangıç Sigma	TR-1003-G	Belirli memeli hücrelerinde retroviral transdüksiyonun verimliliğini artıran katyonik polimer. Ayrıca, homolojiye yönelik onarım için bir Oligodeoksinükleotidin (ODN) virale bağlı girişine izin verebilir
Sükroz, moleküler biyoloji için, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Ultrasantrifüjleme yoluyla Nanoblade saflaştırması için bir yastık hazırlamak için sükroz
SUPERBLADE5	Ekle	134913	Nanoblades sisteminde kullanılacak sgRNA dizisini klonlamak için boş omurga (Chen B ve ark., 2013 aracılığıyla artan genom düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir)
SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Alt Tabaka	ThermoFisher Bilimsel	34076	Cas9 nokta lekeleri için geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) HRP substratı
SW 41 Ti Sallanan Kova Rotoru	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	331362	Ultrasantrifüjleme için rotor
SYBR Güvenli DNA Jel Lekesi	ThermoFisher Bilimsel	S33102 Serisi	Agaroz jellerini boyamak ve DNA'yı görselleştirmek için etidyum bromüre alternatif
T4 DNA Ligaz	New England Biyolojik Laboratuvarları	M0202S Serisi	BLADE veya SUPERBLADES vektörlerini, sgRNA'nın değişken bölgesine karşılık gelen duplekslenmiş DNA oligoları ile bağlamak için DNA ligaz
Triton içeren lizis tamponu	Promega	E291A Serisi	Nanoblade'leri bozmak ve Cas9 nicelleştirmesine izin vermek için lizis tamponu
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416	TBST'nin hazırlanması için

(İngilizce) . Gazetesi Serisi İkinci El Serisi Gazetesi Fuar Gazetesi Serisi