Sivrisinek Embriyo Mikroenjeksiyonu: Germ Hattı Mutasyonları Oluşturmak için Anopheles Gambiae'nin Embriyo Sarısına Ekzojen DNA Verme Tekniği

Özet

Kaynak: Carballar-Lejarazú, R. ve diğerleri, >Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, embriyo mikroenjeksiyon tekniği ile Anopheles gambiae sivrisineğinin embriyosuna gen sürücü yapısının verilmesini gösteriyoruz. Bu prosedür, homolog rekombinasyon yoluyla iletilen DNA yapısının, dönüştürülmüş sivrisinek popülasyonu oluşturmak için germ hattı hücrelerine entegrasyonuna izin verir.

Protokol

1. Embriyo mikroenjeksiyonu

1. İğneleri 2 μL DNA karışımı (300-400 ng/μL konsantrasyonda plazmid DNA) ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın. İğneyi iğne tutucusuna yerleştirin ve otomatik basınç pompası hortumunu bağlayın (Şekil 1).
2. Önemli: İğneyi, kızağın düzlemi ile 15°'lik bir açı yapacak şekilde hizalayın (Şekil 1).
3. Anopheles gambiae sivrisineğinin ilk yumurtasına dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın ve iğnenin ucunu arka kutba 10 μm ≤ sokarak enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmanın küçük bir hareketine yol açacaktır.
4. Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel aşama kontrollerini kullanın.
   1. İğne ucunun açık kaldığından ve tıkanmadığından emin olmak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte düğmesine basın ve iğnenin ağzındaki küçük damlacığı görselleştirin.
   2. İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek için Temizle düğmesine basın ve damlacık görselleştirme testini tekrarlayın. Damlacık boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.
   3. Bir iğne ile ~ 40-50 yumurta enjekte edin.
      not: Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından emin olun. Temiz tutmak için iğne üzerinde yeterli geri basınç tutun. Tıkanıklığı açılamayan bir iğnenin mutlaka yeni bir iğne ile değiştirilmesi gerekir. Sahnenin yatay hareketi için koaksiyel kontrollere sahip mikroskoplar ile embriyo yerleştirme, iğne yerleştirme ve enjeksiyon işlemleri daha kolay hale getirilmiştir (Şekil 2).
5. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mL deiyonize H2O ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın (Şekil 3).
   not: Embriyolar enjeksiyondan 2 gün sonra çatlamaya başlar ve 3-5 gün kadar sürebilir. Yumurtadan çıkan ilk instar larvaları derhal (günde 2 kez kontrol edin) su ve yiyecek içeren temiz bir kaba aktarılmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikroenjeksiyonlar sırasında iğne pozisyonu. A) Enjeksiyon aşamasının geniş açılı görünümü. B,C) İğneyi, hizalanmış embriyolar enjeksiyon iğnesi ile 15°'lik bir açı oluşturacak şekilde konumlandırın. İğne ile embriyoları içeren lam arasında uygun açı sağlamak için mikroenjeksiyon aletinin iğneyi tutan kolunu mikroskop aşamasından önemli ölçüde daha yükseğe kaldırmayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10x Mikroenjeksiyon Tamponu	-	-	1 mM NaHPO4 tamponu, pH 6.8, 50 mM KCl
Lekelenme membranı (Zeta-Probe GT Genomik Test Edilmiş Lekelenme Membranı)	Biyo-Rad		Düzgün ve düz bir şekilde 2x1 cm'lik parçalar halinde kesin
Deiyonize veya çift damıtılmış su (ddH20)	Mili-Q		Bir yıkama şişesinde
Diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi	Leica MZ12	Embriyo hizalaması için
Cam kap	Borcam	3140 sayılı	125 x 65
Cam kaydırak	Balıkçı Markası	Hayır. 12-549-3	75x26 mm boyutlarında
Mikro enjektör	Sutter Enstrümanı		XenoWorks Dijital Mikro Enjektör
Mikro Yükleyici Pipet uçları	Eppendorf Belediyesi		20 μL mikro yükleyici epT.I.P.S.
Mikromanipülatör	Sutter Enstrümanı		XenoWorks Mikromanipülatör
Mikropipet	Yağmur		20 μL
mikroskop	Leica Belediyesi	DM 1000 LED veya M165 FC	Mikroenjeksiyon için
Naylon örgü
Boya fırçası	Blick	No. 05831-7040	İyi, boyut 4/0
Petri kabı			Plastik, (60x15 mm, 90x15 mm)