Hidrodinamik Gen Dağıtımı: Murin Hepatositlerinde Ekzojen DNA'nın Kuyruk Ven Enjeksiyonu ile İn Vivo Transfeksiyonu İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Hubner, E. K. ve diğerleri, Hidrodinamik Kuyruk Damarı Enjeksiyonu Kullanılarak Fare Hepatositlerinin Genetik İn Vivo Modifikasyonu için Yapısal ve İndüklenebilir Sistemler. J. Vis. Exp. (2018).

Bu videoda, murin hepatositlerinin hidrodinamik kuyruk damarı enjeksiyonu ile genetik in vivo transfeksiyon tekniği açıklanmaktadır. Bu transfeksiyon sistemi, hepatositlerdeki transgenin uzun süreli bir ekspresyonunu üretir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hidrodinamik Kuyruk Damarı Enjeksiyonu için Çözelti Hazırlama

NOT: Yetkin bakteriler kullanarak klonlama tekniği ile plazmit yapılarını yapısal ve indüklenebilir gen ekspresyonu için hazırlayın.

1. Enjeksiyon için steril% 0.9 salin hazırlayın (PBS kullanmayın). Fare vücut ağırlığının yaklaşık% 10'una karşılık gelen hacmi kullanın. Örnek: 20 g ağırlığındaki bir fare için 2 mL çözelti hazırlayın.
2. Endotoksin içermeyen bir plazmit saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılmış enjeksiyon vektörlerini hazırlayın.
3. 10 μg veya 15 μg endotoksin içermeyen uyuyan güzel vektör yapısı ekleyin (10 μg kullanın, 4. adımdan itibaren sırasıyla 15 μg kullanın) ve mL steril salin başına 1 μg endotoksin içermeyen pc-HSB5 ekleyin.
4. Solüsyonu 4 °C'de 4 saate kadar saklayın. Dondurmayın.

2. Hidrodinamik Kuyruk Damar Enjeksiyonu Gerçekleştirme

1. Kuyruk damarı enjeksiyonu için bir tutucu kullanın (ticari veya nefes almak ve kuyruk için delikleri olan 50 mL'lik konik bir tüpten hazırlanmış). Tüpün altını kağıt mendil ile doldurun.
2. Enjeksiyon için, 20-25 g ağırlığında yaklaşık 8-10 haftalık fareler kullanın.
3. Enjeksiyondan önce fareleri tartın ve enjeksiyon hacmini vücut ağırlığına göre hazırlayın (vücut ağırlığının %10'una karşılık gelir). Enjeksiyon için 27 G iğneli steril bir 3 mL şırınga hazırlayın ve gerekli hacimle doldurun.
4. Fareyi sınırlayıcıya yerleştirin. Kağıt mendil miktarını, hareket için çok az alan, ancak nefes almak için yeterli alan bırakacak şekilde ayarlayın.
5. Farenin düzenli olarak nefes aldığından emin olun.
6. 30-60 saniye boyunca kızılötesi lamba kullanarak kuyruğu ısıtın. Aşırı ısınma belirtilerini dikkatlice izleyin.
7. Kuyruğu alkollü bir bezle temizleyin.
8. İğneyi, kuyruğun tabanına yakın iki yan kuyruk damarından birine neredeyse yatay olarak sokun.
   not: Başarılı bir şekilde yerleştirilirse, iğnenin konisine az miktarda kan geri akabilir. İğnenin herhangi bir ek hareketi, damarın yer değiştirmesine ve / veya yaralanmasına neden olabileceğinden aktif olarak aspire edilmesi önerilmez.
9. Toplam hacmi 8-10 saniye içinde kuyruk damarına enjekte edin.
10. Fareyi hemen sınırlayıcıdan çıkarın. Enjeksiyon yarasını en az 30 saniye boyunca veya herhangi bir kanama azalana kadar sıkıştırın.
11. Fareyi ayrı bir kafese yerleştirin. Fare prosedürden kurtulduktan sonra (yaklaşık 30-60 dakika), fareyi orijinal kafesine geri aktarın. Sonraki 24 h.
    için fareyi düzenli olarak kontrol edin not: Farenin hafif sedasyonu, enjeksiyondan sonra 2 saate kadar rutin olarak gözlenir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaCl % 0,9	Braun	3200905	İntravenöz enjeksiyonlar için taşıyıcı
Falcon Konik Tüp 50ml	Corning Yaşam Bilimleri	352095
Kızılötesi Lamba	Yok	Yok	Fare kuyruğunun ısınması için
Uyuyan güzelin klonlanması için plazmitler-HTVI için transpozon vektörleri.
pTC	Yok		Yapısal gen ekspresyonu için vektör
pEN_TTmcs	Ekle	#25755	İndüklenebilir gen ekspresyonu için giriş vektörü
pEN_TTGmiRc2	Ekle	#25753	GFP'nin birlikte ekspresyonu ile indüklenebilir miRshRNA ekspresyonu için giriş vektörü
pEN_TTmiRc2	Ekle	#25752	GFP'nin birlikte ekspresyonu olmadan indüklenebilir miRshRNA ekspresyonu için giriş vektörü
pTC ApoE-Tet	Ekle	#85578	ApoE.HCR.hAAT promotor ile indüklenebilir gen veya miR-shRNA ekspresyonu için ekspresyon vektörü
pTC-CMV-Tet	Ekle	#85577	CMV promotor ile indüklenebilir gen veya miR-shRNA ekspresyonu için ekspresyon vektörü

(İngilizce)