Agrobakteri Aracılı Genetik Dönüşüm: Genetik Olarak Tasarlanmış Agrobacterium tumefaciens ile Pirinç Genomunu Genetik Olarak Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Xu, D., et al. Agrobacterium Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışması İçin Uygulaması. J. Vis. Exp. (2020).

Bu videoda, bir Agrobacterium tumefaciens ikili vektörü kullanarak pirinç genomunun genetik dönüşümünü gösteriyoruz. Bu bakteri, Agrobacterium virülans proteinlerini kullanarak yabancı bir DNA plazmidinin transferini kolaylaştırır.

Protokol

1. Pirinç genetik dönüşümü ve bitki doku kültürü

1. Nasır indüksiyonu ve rejenerasyonu
   not: Nasırı indüklemek için başlangıç materyali olarak taze genç pirinç salkımını kullanın (Şekil 1).
   1. Genç çiçek salkımlarını, 1.6-4.8 mm'lik çiçek uzunluğuna göre belirlenen mayoz bölünme aşamasında çeltik tarlasından veya seradan toplayın (Şekil 1A). Pirinç salkımının yaprak kılıfı ile kaplandığından emin olun. Her çiçeklenmeyi% 70 alkollü bir bezle silin ve kesmeden önce kurumasını bekleyin.
   2. Çiçeklenmeyi temiz, steril bir tezgaha getirin. Sterilize edilmiş makasla küçük parçalar halinde kesin (ne kadar küçükse o kadar iyi) ve ardından kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın (Şekil 1B, Tablo 1).
   3. Nasırı indüklemek için plakayı karanlıkta 26 ° C'de yaklaşık 10-14 gün inkübe edin (Şekil 2A).
      not: Agrobacterium infiltrasyonu için yeni oluşan kallusu (adım 1.2.7) doğrudan kullanın veya daha fazla kallus elde etmek için taze NBD2 ortamında bir kez daha yenileyin. Nasırı her 8-10 günde bir yeni NBD2 besiyerine aktarın.
2. Dönüşüm ve birlikte yetiştirme
   1. Transformasyon için sgRNA-CAS9 yapısına sahip ikili plazmid içeren A. tumefaciens bakterilerini kullanın. A. tumefaciens suşlarını daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de% 50 gliserol içeren YEB ortamında (Tablo 1) saklayın.
   2. -80 °C'lik bir gliserol stoğundan seçici antibiyotikler içeren YEB agar ortamına (Tablo 1) çizgi A. tumefaciens ve kolonilerin ortaya çıkmasına izin vermek için 48-72 saat boyunca 25-28 ° C'de büyür.
   3. 50 mL'lik bir konik steril test tüpünde, seçici antibiyotiklerle YEB plakasından tek bir koloniyi aynı seçici antibiyotikleri içeren 5 mL sıvı YEB ortamına aşılayın (Tablo 1). Bakteriler 0,5 OD_600'e ulaşana kadar 25-28 °C'de 250 x g'da bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
   4. 250 mL'lik konik bir şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mL YEB ortamına (Tablo 1) 1 mL bakteriyel süspansiyon ekleyin ve 250 x g'da, 28 ° C'de 4 saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
   5. Bakterileri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   6. Bakteri peletini AAM-AS ortamı ile yeniden süspanse edin (Tablo 1) ve süspansiyonu bir OD₆₀₀ = 0.4'e seyreltin.
      not: Bakteriyel süspansiyonun mükemmel OD'si, verimli dönüşüm için kritik öneme sahiptir. Nasır üzerindeki aşırı bakteri üremesini ortadan kaldırmaya yardımcı olur.
   7. Adım 1.1.3'ten itibaren yaklaşık 150 sağlıklı büyüyen açık sarı kırılgan embriyojenik kallusu 150 mL'lik steril bir şişeye toplayın. Adım 1.2.6'dan itibaren steril şişeye 50-75 mL bakteri hücresi süspansiyonu ekleyin ve ardından ara sıra çalkalayarak kallisi 10-20 dakika daldırmak için 10-25 mL taze AAM-AS ortamı ekleyin.
   8. Bakteriyel süspansiyonu şişeden dikkatlice boşaltın ve steril filtre kağıdı #1 veya kağıt mendil kullanarak nasırdaki fazla bakteri süspansiyonunu kurutun. Daha sonra bunları steril bir filtre kağıdı #1 ile kaplanmış NBD-AS ortamlı (Tablo 1) bir Petri kabına yerleştirin. 25-28 °C'de karanlıkta 3 gün inkübe edin ve bakteri üremesini kontrol edin.
3. Dirençli nasır için seçim
   1. 3 günlük birlikte yetiştirmeden sonra, calli'yi steril bir filtre kağıdı ile steril bir Petri kabına aktarın.
   2. Calli'yi temiz bir tezgahta 2 saat havayla kurutun. Nasırın filtre kağıdına yapışmadığından emin olun.
   3. Steril cımbız kullanarak kallileri birincil seçim ortamı NBD2'ye (40 mg / L higromisin ve 250 mg / L timentin ile) eşit şekilde aktarın (Tablo 1). Karanlıkta 25–28 ° C'de 2 hafta boyunca kültür calli.
   4. 2 hafta sonra, calli'yi taze seçim ortamı NBD2 (40 mg / L higromisin ve 250 mg / L timentin ile) içeren yeni bir plakaya eşit şekilde aktarın (Tablo 1). Calli'yi karanlıkta 25-28 ° C'de 2 hafta daha kültürleyin.
4. Nasır farklılaşması
   1. Kasırı taze MS Medium'a aktarın (25 mg / L higromisin ve 150 mg / L timentin ile) (Tablo 1). Yaklaşık 2 hafta boyunca 25-28 ° C'de ışık altında kültür.
   2. Adım 1.4.1'i bir kez daha tekrarlayın.
   3. Daha fazla sürgün çoğaltmak için sürgün tomurcuklarını yeni MS ortamına (10 mg / L higromisin ile) aktarın.

Tablo 1: Pirinç dönüşümü için ortam bileşimleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Nasırı indüklemek için başlangıç malzemeleri. (A) Mayoz bölünme aşamasında genç pirinç salkımları. (B) NBD2 ortamında büyüyen disseke edilmiş genç çiçek salkımları. Çubuk = 2 cm (A) içinde.

Şekil 2: Agrobacterium aracılı dönüşüm ile tra...