1. Hh reseptörü transgen aşırı ekspresyonu için elektroporasyon: pEGFP-Smo
- 2 mm boşluklu bir küvet kullanarak elektroporasyon için, her elektroporasyon reaksiyonu için aşağıdaki plazmid hücre elektroporasyon karışımını hazırlayın: 1.2 × 106 fare birincil serebellar granül hücre öncü hücreleri ve 10 μg pEGFP-mSmo (DNA stok konsantrasyonunu Tris-EDTA tamponunda ~ 2-5 μg / μL'ye ayarlayın veya steril dH2O) 100 μL Opti-MEM içinde.
not: Hücreler yetersizse toplam hücre sayısını azaltın (ancak bu, elektroporasyon verimliliğini azaltabilir). Ancak, küvet başına kullanılan plazmit miktarını veya toplam Opti-MEM hacmini ayarlamayın. Deney için gereken toplam hücre sayısı 1,5 × 106 hücreyi aşarsa, elektroporasyon karışımını buna göre ölçeklendirin ve ayrı ayrı birden fazla elektroporasyon reaksiyonu gerçekleştirin. Küvet 5 defaya kadar tekrar kullanılabilir.
- Kaplanmış lameller içeren 24 oyuklu kültür plakasının her bir oyuğuna 0,5 mL kültür ortamı ekleyerek elektroporasyon sonrası hücre tohumlama plakasını hazırlayın ve bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de sıcak tutun. Lamelleri hücre tutturması için hazırlamak için, otoklavlanmış 12 mm cam lamelleri 100 μg/mL poli-D-lizin (PDL, steril dH2O'da 1 mg/mL) ile 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin. Lamelleri kullanana kadar aynı PDL solüsyonunda 4 °C'de tutun.
- Gerekli sayıda hücreyi steril 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve RT'de 5 dakika boyunca 200 × g'da döndürün. Süpernatanı atın ve hücre peletini 200 μL Opti-MEM içinde yeniden süspanse edin. Tüpte artık kültür ortamı olmadığından emin olmak için bu adımı Opti-MEM ile iki kez tekrarlayın.
not: 24 oyuklu bir plakanın her kuyusu / lamel için, kültürün ertesi gününde ~% 70-75 hücre birleşmesi elde etmek için 1.2-1.3 × 106 hücre / kuyuya elektroporat ve tohum atın.
- Elektroporasyon parametrelerini Tablo 1'de gösterildiği gibi ayarlayın.
- İyice karıştırmak için elektroporasyon reaksiyonunu nazikçe pipetleyin ve karışımın tam hacmini 200 μL'lik bir hacmi 2 mm aralıklı küvete aktarmak için uzun bir P2 ucu kullanın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Küveti küvet haznesine yerleştirin.
- Elektroporatörün Ω düğmesine basın (Malzeme Tablosuna bakın) ve ~30-35 olması gereken empedans değerini not edin. Elektrik empedans değerinin Ω 30-35 aralığında olmasını sağlamak için 100 μL'lik hassas bir hacme bağlı kalın.
- Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basın.
- Okuma çerçevesinde gösterilen ölçülen akım ve joule değerlerini kaydedin.
- Küveti küvet haznesinden çıkarın.
- Hemen küvete 100 μL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve 2-3 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hemen adım 1.2.
'de hazırlanan kaplanmış lamelleri içeren 24 oyuklu plakaya aktarın
not: Hücre ölümünü en aza indirmek için, elektroporasyondan hemen sonra hücreleri tohumlayın.
- Hücreleri bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin. Hücre ayrılmasını önlemek için hücreleri 3 saat boyunca rahatsız etmeyin.
- Tohumlamadan 3 saat sonra, yüzen ölü hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için süpernatan ortamın yarısını nazikçe aspire edin ve atın ve aynı miktarda önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin.
- Hücreleri CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
| Gözenek Darbe Ayarı | Transfer Darbe Ayarı |
| Fare Birincil GCP'leri | Birincil nöronlar | Fare Birincil GCP'leri | Birincil nöronlar |
| gerilim | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| uzunluk | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| ara | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Hayır. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D oranı | %10 | %10 | %40 | %40 |
| Po -larite | + | + | ± | ± |
Tablo 1: Super Electroporator NEPA21 TİPİ kullanılarak fare birincil GCP'lerinin ve birincil nöronların elektroporasyon parametreleri
