$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Merozoitlerin veya sporozoitlerin nükleofeksiyonu
- Parazitlerin nükleofeksiyonundan önce hazırlık
- Bir tüpte yaklaşık 10,7 merozoit veya sporozoit hazırlayın. Merozoitleri transfekte ediyorsanız, 3-4 tüp hazırlayın.
- 10 μg.
'a eşit veya daha büyük bir miktarda plazmit DNA veya saflaştırılmış PCR fragmanı hazırlayın
not: Bu çalışmada kullanılan plazmit 2 gen içerir: geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ve Toxoplasma gondii'den (TgDHFR-TS) türetilen dihidrofolat redüktaz timidilat sentaz.
- 25 U kısıtlama enzimi hazırlayın. Plazmitler doğrusallaştırılırsa, kısıtlama enzimi transfeksiyon verimliliğini artırabilir. Plazmitler dairesel ise, kısıtlama enzimini atlayın.
- 85 μL nükleofeksiyon tamponu hazırlayın (Tablo 1): 20 μL nükleofeksiyon tamponu I ve 1 mL nükleofeksiyon tamponu II'yi karıştırın ve çözeltinin bir kısmını kullanın. Toplam tamponun hacmi 100 μL'dir.
- Nükleofeksiyon
- Sporozoit veya merozoit süspansiyonunu 600 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Sonra süpernatanı atın.
- Aşağıdaki sırayla, sporozoitler veya merozoitler içeren 1.5 mL'lik tüpe 85 μL nükleer transfeksiyon tamponu, 10 μg plazmid (PCR fragmanı) ve 25 U kısıtlama enzimi (genellikle 5 μL) ekleyin.
- Süspansiyonu bir nükleer transfeksiyon kabına aktarın. Bardağı nükleer bir transfer oluğuna koyun.
- Güç düğmesini kullanarak nükleofeksiyon cihazını açın ve transfeksiyon prosedürü U-033'ü seçin. Nükleofeksiyon cihazı Serbest Program Seçimi modunda başlarsa, X düğmesine basarak bu moddan çıkın.
- Program bittiğinde, nükleofeksiyon cihazının X düğmesine basın ve ekranda nükleofeksiyonun başarılı olduğunu gösteren OK görüntülenmelidir.
- Reaksiyonu durdurmak için nükleofeksiyon kabına 0.5-1 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu (DMEM) ekleyin ve süspansiyonu hafifçe karıştırdıktan sonra 1.5 mL'lik tüpe aktarın.
| arabellek
|
kompozisyon
|
| Nükleofeksiyon tamponu I | ATP-disodyum 2g, MgCl2-6H 2O 1.2g, 10 ml su |
| Nükleofeksiyon tamponu II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0.6 g, glikoz 0.2 g, 500 ml su |
| *Su: Damıtılmış su | |
Tablo 1: Tamponların Bileşimi.