$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Döllenmiş yumurtalardan kümülüs hücrelerini çıkarın.
- Stereomikroskop altında 2 insülin şırıngası kullanın: ilki yumurta kanalını tutmak için, ikincisi ise ampullayı yırtmak ve döllenmiş yumurtaları hyaluronidaz çalışma çözeltisine dağıtmak için.
- Yumurtaları toplamak için hazırlanan cam pipeti alın ve tüm yumurtaları aspire etmek için boruya ve ağızlığa monte edilmiş 0,22 μm'lik bir filtreye bağlayın. Tüm yumurtaları toplayın ve 6 farklı damla 100 μL M2 ortamına art arda geçirerek yıkayın.
- Yıkanmış döllenmiş yumurtaları M16 ortamında% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C inkübatöre koyun.
2. Enjeksiyon Pipetleri Yapımı
- Dış çapı 1 mm olan ince duvarlı cam kılcal boru (10-15 cm uzunluğunda) kullanın ve bu kılcal damarı yatay mikropipet çekicisine sıkıştırın.
not: Çoğu yatay pipet çektirmesinde 3 parametre ayarlanabilir: ısı gücü, çekme gücü ve ısıtma ile çekme arasındaki zaman gecikmesi. Şekil 1A'da sunulana benzer enjekte edici pipetler elde etmek için bu parametreleri ayarlayın. Rutin olarak DNA mikroenjeksiyonu yapan kullanıcılar için, standart ayarları kullanın ve pipet ucunun genel şeklini değiştirmek için ısıtma ve çekme arasındaki gecikmeyi ayarlayın.
3. Tutma Pipetleri Yapımı
- Tutma pipetini hazırlamak için bir enjeksiyon pipeti kullanın.
- Bir microforge'a bir enjeksiyon pipeti takın. 80 ila 100 μm çapında keskin bir simetrik uç elde etmek için pipeti microforge ile kesin. Ardından, keskin çitler olmadan simetrik yuvarlak bir şekil elde etmek için ucu microforge üzerinde ısı ile parlatın.
4. Lentiviral Vektör İçeren Enjeksiyon Pipetinin Hazırlanması
- Lentiviral vektör süspansiyonunu, genellikle donmuş lentiviral stoklarda bulunan pelet kalıntılarına 2 dakika boyunca 160 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı geri kazanın ve sınıf II güvenlik kabininde 0,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
- 1 μL süpernatanı, bir Mikro yükleyici kullanarak adım 5'te açıklandığı gibi hazırlanan bir enjeksiyon pipetine aktarın.
- Enjeksiyon pipetini sağ mikromanipülatörün alet tutucusuna yerleştirin. Tutma pipetini sol mikromanipülatöre bağlayın.
not: Lentiviral vektörün transdüksiyon başlığı, kurucu üretiminin etkinliği ile doğrudan ilişkilendirilecektir. Yüksek etkinlik için (% >70), 100 ng p24 kapsid proteini / μL aralığında bir titter içeren viral vektörler kullanın. Titre, transdüksiyon birimleri (TU) olarak ifade edildiğinde, baştankara 109 TU / mL'nin üzerinde olmalıdır. Lentiviral vektör stokları, ek yöntemlerde açıklandığı gibi veziküler stomatit virüsü (VSV) glikoprotein-G'yi kodlayan p8.91 kapsülleme plazmidi, pHCMV-G ile 293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu ile üretilmelidir.
5. Mikro Enjeksiyon
- Bir çöküntü slaytının ortasına 8 μL M2 ortamı dağıtın ve buharlaşmayı önlemek için hafif parafin yağı (embriyo test edilmiş) ile kaplayın.
- 20 yumurtayı mümkün olduğunca az dağılmış şekilde damlaya koyun.
Dikkat: Embriyoları yatırırken baloncuk yapmayın.
- Enjeksiyon pipetinin ucunun açık olduğundan emin olun. Değilse, enjeksiyon pipetine tutma pipeti ile hafifçe vurun.
- Mikroenjektörü 20 s.
'lik bir enjeksiyon süresine ayarlayın
not: Viral süspansiyonun viskozitesi, viral vektörün perivitellin boşluğundaki dağılımının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Enjeksiyon basıncı, enjeksiyondan sonraki 20 saniye içinde tüm alanı dolduracak şekilde ayarlanmalıdır, bu da 10 ila 100 pL'lik bir hacmi temsil eder. Enjeksiyon basıncı 600 hPa'yı geçmemelidir.
- 2 pronükleus ve 2 polar cisim içeren bir döllenmiş yumurtayı stereomikroskop altında tutma pipeti ile aspire edin.
- Yumurtayı mikroenjektör ile perivitellin boşluğuna enjekte edin.
Dikkat: Enjeksiyon pipeti ile plazma zarına dokunmayın.
- Mevcut tüm döllenmiş yumurtaları 20 yumurtalık gruplar halinde enjekte edin ve enjekte edilen yumurtaları hemen önceden ısıtılmış M16 ortamına% 5 CO2.
atmosferli nemlendirilmiş 37 ° C inkübatöre yerleştirin
not: Enjekte edilen yumurtaları embriyo transferlerinden önce enjeksiyondan sonra en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
