Lazer Destekli Lentiviral Gen Dağıtımı: Lentiviral Gen Dağıtımını Kolaylaştırmak için Fare Döllenmiş Yumurtalarını Geçirgen Hale Getirme Tekniği

Özet

Kaynak: Martin, N. P., et al. Fare Döllenmiş Yumurtalarına Lazer Destekli Lentiviral Gen İletimi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, lentiviral gen iletimini kolaylaştırmak için fare döllenmiş yumurtalarında zona pellucida'nın koruyucu tabakasının lazer destekli nüfuzunu gösteriyoruz. Lentivirus, genomlarına istikrarlı bir şekilde entegre edilmiş bir ilgi genine sahip transgenik hayvanların üretilmesini sağlar.

Protokol

1. Fare Döllenmiş Yumurtalarının XYClone Lazer ile Delinmesi

1. XYClone lazeri üreticinin tavsiyesine göre kurun ve kalibre edin. Tipik olarak in vitro fertilizasyon için kullanılan diğer lazerler, döllenmiş yumurtaları delmek için XYClone lazerin yerini alabilir.
   1. Lazer kontrol kutusu kablosunu mikroskop üzerindeki lazer aparatına takın.
   2. Lazer denetleyici kutusunu bir USB bağlantı noktası aracılığıyla lazer yazılımını çalıştıran bilgisayara takın. 3.1.3. Lazer denetleyiciyi prize takın ve açın.
   3. Göz merceğinden bakarak, bir test numunesini delin (örn. bir cam slayt üzerindeki kuru silme işaretleri).
   4. Lazerin X ve Y konumunu mikroskop merceğinden görünen LED ışığıyla eşleşecek şekilde ayarlamak için küçük bir tornavida (lazer kitinde bulunur) kullanın ve lazeri kalibre edin.
2. Mikroskop tablasına fare döllenmiş yumurtaları içeren bir KSOM damla plakası yerleştirin. Plakayı 15 dakikadan fazla kuluçka makinesinin dışında tutmayın.
3. Mikroskop merceğinden bakın ve embriyonun zona pellucida'sının odakta olduğundan ve lazer LED ışığının görünür olduğundan emin olun.
4. LED ışık/lazer ile bölgeyi hedeflemek için mikroskop aşamasını hareket ettirin.
5. Bilgisayar yazılımını kullanarak XYClone lazeri 250 μs'ye ayarlayın.
6. LED ışık boyutunu istediğiniz boyutlara ayarlayın (bu deneyde ayar 5).
7. Döllenmiş her yumurtanın zonasını lazerle üç kez delin. Zon delinebilir veya inceltilebilir. Yukarıdaki ayarları kullanarak, lazer 10 μm çapında bir delik oluşturacaktır (Şekil 1).
   not: Kutup cismine yakın nişan almak, lazeri embriyonik hücreden uzak tutar.
8. Bir sonraki adıma geçmeden önce döllenmiş yumurtaların doku kültürü inkübatöründe 2 saat iyileşmesine izin verin.

2. XYClone Lazer Perforasyonunu Takiben Fare Döllenmiş Yumurtalarının Transdüksiyonu

1. 50 μL KSOM damlasına 2 μL konsantre lentivirüs (1e8 TU / mL titreden büyük) pipetleyin. Yukarı ve aşağı pipetlemeyin. Döllenmiş yumurtalar pipet ucuna kolayca yapışır. Deneyimlerimize dayanarak, 3 μL'den daha az bir hacimde 1e5-5e5 lentivirüs birimlerinin dönüştürülmesi, gen iletimi için en uygunudur.
2. Döllenmiş yumurtaların kuluçka makinesinde 4 gün boyunca blastosiste dönüşmesine izin verin. Medyayı değiştirmeye gerek yok.

3. Dönüştürülen Fare Embriyolarının Yalancı Hamile Farelere Ameliyatsız Transferi

1. Çiftleşmeden 3.5 gün sonra yalancı gebe fareler kullanın.
2. Fare embriyolarını yalancı gebe farelere implante etmek için Cerrahi Olmayan Embriyo Transferi (NSET) cihazını kullanın.
   1. Cerrahi veya diseksiyon mikroskobu kullanarak, rahim ağzını görselleştirmek için vajinal bir spekulum yerleştirin.
   2. Ameliyatsız Embriyo Transferi (NSET) cihazını rahim ağzına yaklaşık 5 mm yerleştirin ve embriyoları yaklaşık 2 μL.
      not: Her transfer için steril bir NSET cihazı kullanılır ve işlemden sonra atılır. Embriyoların manipülasyonunda kullanılan tüm reaktifler steril olmalıdır.
3. Her bir psödogebe fareye 2 μL KSOM hacminde 10-15 sağlıklı blastosist aktarın.
4. NSET'in başarılı olup olmadığını belirlemek için sonraki günlerde yalancı gebe farelerde kilo alımını izlemeye ve ölçmeye devam edin.
5. Hamile farelerin doğal olarak doğum yapmasına izin vererek veya embriyo transferinden 17 gün sonra sezaryen yaparak yavruları kurtarın. Çok az sayıda embriyo varsa ve doğal doğum için çok büyürlerse sezaryen genellikle gereklidir.
6. Transgenez oranını belirlemek için genotipleme için yavrulardan doku toplayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Fare döllenmiş yumurtalarının lazer tedavisi. Bir delik oluşturmak için zonanın delinmesine ve zonanın incelmesine ilişkin örnekler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CD510B-1 plazmidi	Sistem Biyobilimleri	CD510B-1	EF1a-copGFP eksprese eden lentivirüsü paketlemek için kullanılır
Dimetilpolisiloksan	Sigma	DMPS5X	Embriyoların kültürlenmesi
XYClone Lazer	Hamilton Thorne Biyobilimler		Fare Döllenmiş Yumurtaları Delmek
Ameliyatsız Embriyo Transferi (NSET) Cihazı	ParaTech'ler	60010	Embriyoların NSET'i
KSOM orta	Kırlangıç	BAY-020P-5F	Embriyoların kültürlenmesi
KSOM'un Bileşimi:			mg/100 mL
NaCl (Doğal)			555
Kartal			18,5
KH2PO4			4,75
MgSO4 7H2O			4,95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
glikoz			3.6
Na-Piruvat			2.2
DL-Laktik Asit, sodyum tuzu			0,174 milyon
10 mM EDTA			100μL
Streptomisin			5
penisilin			6.3
% 0.5 fenol kırmızısı			0,1 milyon
L-Glutamin			14,6
MEM Esansiyel Amino Asitler			1 mL
MEM Gerekli olmayan AA			0,5 mL
Bsa			100

Serisi TL