Biyolistik Aracılı Gen Transferi: İlgilenilen Geni Bir Biyolistik Gen Tabancası ile Hedef Hücrelere İlgilendirme Tekniği

Özet

Kaynak: Taylor, T., et al. Floresan Etiketli Bir Genin Fırsatçı Mantar Patojeni Cryptococcus neoformans'a Biyolistik Dönüşümü. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde biyolistik gen tabanca aracılı gen iletiminin protokolünü gösteriyoruz. Bu yöntem, minimum miktarda DNA kullanarak basit bir kararlı genetik dönüşüm yöntemi sağlar.

Protokol

1. DNA Hazırlama

1. Turuncu makro taşıyıcı biyolistik diskleri forseps kullanarak %100 etanole batırarak hazırlayın. Diskleri kuruması için drierite içeren büyük bir petri kabına yerleştirin (drieritin disklere temas etmediğinden emin olun).
2. Kuruduktan sonra, makro taşıyıcı diskleri gümüş disk tutuculara bastırın (daha önce %100 etanol ile silinmişti).
3. % 100 etanol ve alikot 12 μl içinde 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, dönüşüm başına bir tüp olmak üzere süspanse edilmiş vorteks altın mikro taşıyıcı boncuklar.
4. Her tüpe sırayla ekleyin: 2 μg DNA (tercihen 2 μl 1 μg / μl DNA), 10 μl 2.5 M_CaCl2 ve 2 μl 1 M spermidin içermeyen baz.
5. Adım 1.4'teki gibi negatif bir kontrol ayarlayın, ancak DNA olmadan.
6. Her tüpü vorteksleyin ve 5 dakika boyunca ortam sıcaklığında inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında çöken boncukları yeniden süspanse etmek için her tüpü ara sıra hafifçe vurun.
7. DNA kaplı altın boncukları peletlemek için tüpleri 30 saniye boyunca 225 x g'da döndürün. Süpernatanı dikkatlice çıkarın (pipetleme veya aspirasyon ile) ve atın.
8. Boncukları 600 μl %100 etanol içinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek tamamen yeniden süspanse edin.
9. Boncukları paketlemeden peletlemek için tüpleri 30 saniye boyunca 225 x g'da döndürün. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
10. DNA kaplı altın boncukları 8 μl %100 etanol içinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
11. DNA kaplı altın boncukları 1 cm çapında biyolistik diskin ortasına pipetleyin ve kurumasını bekleyin.
    not: Biyolistik diskin merkezinde görünen kurumuş bir altın daire, yeterli konsantrasyonda altın boncukların mevcut olduğunu gösterir.
    not: DNA kaplı altın boncuklarla yüklenen makro taşıyıcı diskler artık gen tabancası ile kullanıma hazırdır.

2. Gen Tabancasını Çalıştırma

1. Vakum pompasını açın.
2. Basınç göstergesinde yaklaşık 2,200 psi'lik bir basınca ulaşılana kadar düğmeyi saat yönünün tersine çevirerek helyum gazını açın.
3. Soldaki kırmızı düğmeyi çevirerek gen tabancasını açın.
4. Vakum ve havalandırma için akış hızlarının, vakumun 28 saniye içinde 15 inç Hg'ye ulaşacak şekilde ayarlandığından emin olun.
5. Yırtılma diski ile makro taşıyıcı arasındaki mesafenin yaklaşık 3/8 inç olduğundan emin olun.
6. Etanol ile silerek tüm hazneyi temizleyin.
7. Patlama disklerini %100 etanole batırın. Steril bir yüzeyde kurumaya bırakın (örn. Petri kabı).
8. Yırtılma diski tutucusunu gevşetmek için bir tork anahtarı kullanın. Tutucuya temiz bir yırtılma diski yerleştirin. Patlama diski tutucusunu tekrar yerine vidalayın ve tork anahtarıyla bir kez sağa çevirerek sıkın.
   not: Yırtılma diskleri her çekimden sonra değiştirilecektir.
9. Kafes ızgaraları %100 etanole batırın. Steril bir yüzeyde kurumaya bırakın (örn. Petri kabı).
10. Kuruduktan sonra, beyaz plastik montaj plakasına yıkanmış bir örgü elek yerleştirin. Makro taşıyıcı disk tutucuyu DNA tarafı aşağı bakacak şekilde disk bölmesine yerleştirin. Gümüş kapağı vidalayın ve montaj plakasını en yüksek yuvaya yerleştirin.
    not: Kafes ekran her çekimden sonra değiştirilecektir.
11. Alt plakaya 1 M sorbitol içeren bir YPD agar plakası yerleştirin.
12. Oda kapısını kapatın ve yerine kilitleyin.
13. Vakumu devreye sokmak ve vakumun 28 inç Hg'ye ulaşmasını sağlamak için ortadaki kırmızı anahtarı yukarı itin ve basılı tutun. Uygun vakum seviyesine ulaşıldığında, bu anahtarı aşağı konuma getirin. Hazır olduğunuzda, ateş etmek için sağdaki kırmızı düğmeyi basılı tutun. Yırtılma diski patladığında, hemen ateşleme düğmesini bırakın ve hazneyi 0 psi'ye çıkarmak için ortadaki kırmızı anahtarı orta konuma itin.
14. Yırtılma diski kalıntılarını temizleyin ve gen tabancasını kapatın. Ardından düğmeyi saat yönünde çevirerek helyum gazını kapatın ve son olarak vakum pompasını kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.6 μm altın boncuk	Biyo-Rad	165-2262	http://www.bio-rad.com
Spermadin içermeyen baz	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350 psi Kopma Diskleri	Biyo-Rad	165-2330	http://www.bio-rad.com
Ekranları Durdurma	Biyo-Rad	165-2336	http://www.bio-rad.com
Makro taşıyıcılar diskler	Biyo-Rad	165-2335	http://www.bio-rad.com
PDS-1000/HE Sistemi	Biyo-Rad	165-2257	http://www.bio-rad.com
Mikrofüj 18 Santrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	F241.5P	www.beckmancoulter.com

Serisi