$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Poli-ornitin/Laminin (Po/L) Çanak Kaplama
NOT: Hacimler, 24 oyuklu bir plakayı kaplamak için uyarlanmıştır.
- Gerekirse, kuyuya 12 mm'lik steril bir lamel koyun.
- Kuyuları suda çözünmüş 500 μL 10 μg/mL Poli-L-Ornitin çözeltisi ile kaplayın.
- Kuyuların 1 saat oda sıcaklığında oturmasına izin verin.
- Poly-L-Ornitin solüsyonunu çıkarın ve 30 dakika havayla kurutun.
- Kuyucukları gece boyunca 37 ° C'de bikarbonat L-15.
içinde 500 μL 3 μg / mL laminin ile kaplayın
not: Kuyular inkübatörde 7 gün boyunca 37 ° C'de saklanabilir. Uzun inkübasyonlar için, kuyucuklar arasına steril PBS eklemek, orta buharlaşmayı önlemeye yardımcı olabilir.
2. Motor Nöron Kültürü
- MN'leri uygun yoğunluğa, genellikle 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 500 μL kültür ortamında 5.000 ila 10.000 hücreye seyreltin.
not: Tohumlama yoğunluğu, 6 ve 96 oyuklu plakalar için sırasıyla 30.000 ve 1.500 hücre civarındadır.
- Laminin solüsyonunu bir P1000 ile çıkarın.
- Kurumayı önlemek için kültür ortamında seyreltilmiş MN'leri hemen kaplama plakalarına aktarın.
- Kültürü 37 ° C'de 2 gün inkübe edin.
3. Motor Nöronların Manyetofeksiyonu
NOT: Aşağıdaki adımlarda, kullanılan miktarlar 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğunun transfeksiyonu içindir. Başka bir format için lütfen üreticinin protokolüne bakın.
- DNA hazırlığı için, 1 μg DNA'yı 50 μL nöronal kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 5 saniye boyunca girdaplayın. Burada, nörofilament cDNA'yı kontrol eden bir CAGGS promotor (pCAGEN) ile 9 kb plazmit kullanılır.
- Boncuk tüpü hazırlığı için, 50 μL nöronal kültür ortamında 1.5 μL boncukları yeniden süspanse edin.
- 50 μL'lik boncuk çözeltisini 50 μL'lik DNA çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin (toplam hacim = 100 μL).
- Bu inkübasyon sırasında, transfekte edilecek kuyudan 100 μL kültür ortamı çekin.
NOT: 37 °C'ye ısıtmak için manyetik plakayı inkübatöre koyun.
- 100 μL DNA / boncuk karışımını kuyuya aktarın ve plakayı manyetik plaka üzerinde 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.