1. Retroviral Yapıyı Hazırlayın
- T hücresi reseptörü (TCR) alfa ve beta zincirlerini, bir 2A bağlayıcı ile ayrılmış, MSCV tabanlı bir retroviral vektöre (örnek, pMIAII veya pMIGII) alt klonlayın.
not: 2A bağlayıcı, tek bir açık okuma çerçevesinden alfa ve beta TCR zincirlerinin stokiyometrik ve uyumlu ifadesine izin verir. Vektör, transdüksiyon hücrelerini ve transdüksiyon verimliliğini izlemek için kullanılan bir IRES floresan protein kaseti (ametrin veya GFP) içerir.
- Ticari olarak elde edilen bir plazma hazırlama kiti veya benzer bir ürün kullanarak Plazmid DNA'yı izole edin. 1-2 μg μl-1'lik bir çalışma konsantrasyonu kullanın.
2. Retroviral Üretici Hücre Hatlarının Oluşturulması
- Retroviral üretici hücre hatlarını üretmek için iki aşamalı bir süreç kullanın.
- Üç plazmit (pVSVG, pEQ-Pam3 (-E) ve ilgilenilen vektör) ile 293T hücrelerinin geçici transfeksiyonu ile retrovirüs oluşturun ve GP + E86 ekotropik retroviral üretici hücre hattını dönüştürmek için 293T hücrelerinden retroviral süpernatantı alın.
- Floresan eksprese eden GP+E86 üretici hücrelerinin ilk %40'ını FACS ile izole edin ve transdüksiyona uğrayan GP+E86 üretici hücrelerini virüsün kaynağı olarak çoğaltın.
not: Yüksek titreli üreticilerin üretilmesi, kemik iliği hücrelerinin verimli bir şekilde transdüksiyonu için kritik öneme sahiptir.
>3. Retrovirüs Aracılı Kök Hücre Gen Transferi (Gün -5)
- Bu protokolün 0. gününe kadar iki birleşik 150 mm'lik plaka için yeterli büyümeye izin vermek için her GP + E86 üretici hücre hattının 0.5 -1.0 x10 6'sını tam DMEM% 10 (hacim / hacim) FBS'de çözün ve kültürleyin.
not: Her GP+E86 üretici hücre hattının 0,5 - 1,0 x10 x 6 adet 10 cm'lik bir plakada çözülmesi, 5. günde %30 - 50 birleşmeye izin verecektir. Bu aynı zamanda GP + E86 üretici hücre hatlarını Gün 0'a kadar iki birleşik 150 mm'lik plakaya genişletmek için 5 günlük kültüre izin verir.
- Mikoplazma kontaminasyonunu önlemek için %5 fetal buzağı serumu ve siprofloksasin (10 μg/ml) içeren tam doku kültürü ortamında kültür retroviral üretici hücre hattı.
not: Kemik iliği transdüksiyonu için viral süpernatan üretirken siprofloksasin kullanımını durdurun. Kemik iliği transdüksiyon verimliliğini olumsuz yönde etkileyeceğinden, üretici hücre hattının aşırı büyümesinden kaçının.
>4. Retroviral Üretici Hücre Kültürü (Gün 0)
- Plaka 3 x 10150 mm plaka başına 6 retroviral üretici hücre, 18 ml tam DMEM, %20 (hacim/hacim) FBS.
- Retroviral üretici hücreleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 15 milyon kemik iliği hücresi (yaklaşık 2-3 donör fare) için 150 mm'lik bir plaka bekleyin.
5. Retroviral Süpernatan (1. Gün)
- Ertesi gün (yaklaşık 24 saat sonra), retroviral süpernatanı 10 ml'lik bir şırınga ile 150 mm'lik plakadan doğrudan çekerek ve 0.45 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyerek retroviral süpernatanı üretici plakalarından (adım 4'te ayarlanır) hasat edin.
- Çıkarılan retroviral süpernatanı 18 ml taze tam DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS ile dikkatlice değiştirin.
- Filtrelenmiş retroviral süpernatanı IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) ve Heksadimetrin bromür (Polibren) (6 μg ml-1) ile destekleyin.
not: Heksadimetrin bromür, retroviral transdüksiyonun etkinliğinde bir düşüşü önlemek için her 2 ayda bir taze yapılmalıdır.
6. Retroviral Süpernatan ve Transdüksiyon (2. Gün)
- 24 saat sonra, viral üretici hücre hattından taze viral süpernatan toplayın. 10 ml'lik bir şırınga ve 0.45 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak retroviral süpernatanı filtreleyin. Filtrelenmiş retroviral süpernatanı IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) ve SCF (50 g ml-1) ve Heksadimetrin bromür (6 g ml-1) ile destekleyin.
- Daha sonra, kemik iliği hücrelerini içeren altı oyuklu plakanın her bir oyuğundan bir pipetle dikkatlice çıkarın veya en üstteki 2 ml ortamı aspire edin.
not: Genellikle kuyu ortasında yoğunlaşan kemik iliğini aspire etmemek için dikkatli çalışın. Alternatif olarak, çıkarılan süpernatant, kaybedilen kemik iliği hücrelerini geri kazanmak için döndürülebilir.
- Kemik iliğindeki her bir oyuğa 6 oyuklu plaka, sitokinler ve Heksadimetrin bromür içeren 3 ml taze viral süpernatan ekleyin. Plakaları plastiğe sarın ve sıkma iletimini 1.000 x g'da 60 dakika boyunca 37 °C'de tekrarlayın. Plakaları açın ve hücreleri gece boyunca (yaklaşık 24 saat) 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
>7. Taze Takviye DMEM İlavesi (3. Gün)
- 24 saat sonra, adım 6.2'de olduğu gibi, kemik iliği hücrelerini içeren altı oyuklu plakanın her bir oyuğundan üst 2 ml ortamı çıkarın. Çıkarılan ortamı, nihai IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) ve SCF (50 g ml-1) konsantrasyonları ile desteklenmiş taze DMEM% 20 (hacim / hacim) FBS ile değiştirin.
- Kemik iliği plakalarını 37 ° C CO2 inkübatörde 24 saat daha inkübe edin.
