Yağ Kırmızısı O Boyama: İn Vitro Hepatik Steatozu Tespit Etmek için Hepatositlerde Nötr Lipidlerin Boyanması İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Campos-Espinosa, A. ve diğerleri, İn Vitro Deneysel Steatoz Modeli: Lipid Aşırı Yüklenmeye Bağlı Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, karaciğerde hepatik steatoz veya aşırı yağ birikimini tespit etmek için hepatositlerdeki nötr lipidlerin in vitro boyanmasını gösteriyoruz. Hücrelerde lipid damlacıkları şeklinde aşırı yağ birikir. Oil Red O, bu lipid damlacıklarındaki hücre içi nötr lipidlere bağlanan, yağda çözünen bir boyadır. Işık mikroskobu altında gözlemlendiğinde, bu hücre içi lipid damlacıkları yoğun kırmızı renkte görünür.

Protokol

1. Yağ Kırmızısı O ile lipit boyama

1. 24 oyuklu bir plakadaki her oyuğa bir hücre kültürü lamel koyun.
2. Oyuk başına 100.000 HepG2 hücresi tohumlayın. 1 mL standart RPMI 1640 ekleyin.
3. 37 °C'de ve %5 CO2'de 24 saat önceden inkübe edin.
4. Steatojenik ortam için standart RPMI 1640 ortamını değiştirin.
5. 24 saat, 2 gün, 3 gün ve 4 gün inkübe edin, her 24 saatte bir steatojenik ortamı yenileyin.
6. Uygun zamandan sonra, süpernatanı atın.
7. 1 mL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın. Süpernatanı atın.
8. PBS'de 1 mL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
9. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
10. Fazla paraformaldehiti atın.
11. Hücreleri 1 mL damıtılmış su ile durulayın.
12. 1 mL %70 izopropanol ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
13. İzopropanol fazlalığını atın. Bu noktada bir PBS yıkamaya gerek yoktur.
14. 1 mL Yağ kırmızısı O çözeltisi ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.
15. Yağ kırmızısı O çözeltisinin fazlalığını atın.
16. 1 mL damıtılmış su ile durulayın.
17. 500 μL hematoksilen çözeltisi ekleyin. 3 dakika inkübe edin.
18. Hematoksilen çözeltisinin fazlalığını atın.
19. 1 mL damıtılmış su ile durulayın.
20. Mikroskop altında 400x büyütmede gözlemleyin (Objektif 40x, Oküler 10x).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kültür ortamı RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, ABD	31800-022	-
Fetal Sığır Serumu (FBS)	ThermoFisher-Gibco, ABD	A4766801	-
HepG2 hücre hattı	ATCC, ABD	HB-8065	Hepatoselüler karsinom insan hücreleri.
Nemlendirilmiş inkübatör	Termo Elektronik Şirketi, ABD	Ürün Kodu: 3110	Sıcaklık (37 °C ± 1 °C), nem (%90 ± %5), CO2 (%5 ± %1)
Ters mikroskop Eclipse	NIKON, JPN	Modeli: TE2000-S	-
İzopropanol	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	I9030-4L	-
Yağ Kırmızı O Kiti	Abcam, Amerika Birleşik Devletleri	ab150678	Nötr yağın histolojik görselleştirilmesi için kit.
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	P6148-500G	-
Penisilin / streptomisin	ThermoFisher-Gibco, ABD	15140-122	Antibiyotikler 10.000 U/mL Penisilin, 10.000 μg/mL Streptomisin
Fosfat tamponlu salin	ThermoFisher-Gibco, ABD	10010-023	-
Serolojik Pipetler	Sarstedt, Avustralya	86.1253.001	Pirojenik olmayan, steril, 5 mL
Serolojik Pipetler	Sarstedt, Avustralya	86.1254.001	Pirojenik olmayan, steril, 10 mL
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich, Amerika Birleşik Devletleri	S5761-1KG	Kültür ortamının hazırlanması
Sodyum oleat	Santa Cruz Biyoteknoloji, ABD	SC-215879A	-
Sodyum palmitat	Santa Cruz Biyoteknoloji, ABD	SC-215881	-
Tripsin% 0.05 / EDTA 0.53 mM	Corning, ABD	25-052-CL	-
24 kuyulu hücre kültürü kümesi	Corning, ABD	3524	Kapaklı düz tabanlı. Doku kültürü tedavi edildi. Pirojenik olmayan, polistiren, steril. 1/Paket.

Serisi (İngilizce) Serisi adet