Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Murin Aort VSMC'lerinin İzolasyonu ve Kalsifikasyonu
- Aort Sindirim Solüsyonu:
- 175 U / ml tip 2 kollajenaz ve 1.25 U / ml elastaz içeren Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile taze bir çözelti (hasat edilen aort başına ~ 3-5 ml) hazırlayın. Solüsyonu 0,22 μm vakumla çalışan bir filtrasyon sistemi ile sterilize edin ve solüsyonu kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Hücre Ortamı:
- 500 ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) %10 fetal sığır serumu, 100 ünite/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin ile destekleyin. Kullanmadan önce ortamı 37 °C'ye ısıtın.
- Kalsifikasyon Ortamı:
- Kalsifikasyon Ortamı A (NaPhos; fare hücre hatlarında kullanılır):
- % 10 fetal sığır serumu, 2 mM sodyum fosfat, 100 birim / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin ile 100-500 ml DMEM (gerektiği gibi hacim) takviye edin. Kullanmadan önce ortamı 37 °C'ye ısıtın.
Veya
- Kalsifikasyon Ortamı B (ΒGP/Asc/DEX; fare veya insan hücre hatlarında kullanılır):
- % 10 fetal sığır serumu, 10 mM β-gliserofosfat disodyum, 50 μg / ml L-askorbik asit, 10 nM deksametazon, 100 birim / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin ile 100-500 ml DMEM (gerektiği gibi hacim) takviyesi. Kullanmadan önce ortamı 37 °C'ye ısıtın.
2. Fare Diseksiyonu
- Fareyi 200 mg / kg intraperitoneal pentobarbital enjeksiyon ile ötenazi yapın.
- Hayvanı diseksiyon tahtasına sırtüstü yatırın ve her bir pençeyi tahtaya bantlayarak stabilize edin. Diseksiyon mikroskobu ve küçük bir makas kullanarak, alt karın bölgesinden üst toraksa uzanan orta hat kesisi yapın.
- Cildi forseps ile geri soyun ve karın organlarını ortaya çıkaran peritonu çıkarın. Aortu kesmemeye dikkat ederek gastrointestinal organları çıkarın.
- Ön diyaframda lateral bir kesi yapın ve kesiye karın boyunca devam edin. Diseksiyon makası kullanarak, kaburgaların yanlarından keserek ve sternumun üst kısmına yapışan yumuşak dokuyu çıkararak göğüs kafesini serbest bırakın. Akciğerleri ortaya çıkaran göğüs kafesini çıkarın.
- Başlangıçta kalbi yerinde bırakın (proksimal aortun tanımlanmasına ve diseksiyonuna yardımcı olmak için) ve akciğerleri dikkatlice çıkarın. Timus, trakea ve yemek borusunu dikkatli bir şekilde çıkarın ve aortun sağlam kalmasını sağlayın.
- Düz ince forseps ve mikro diseksiyon makası kullanarak, peri-aortik yağı çıkarırken dikkatli bir şekilde aortu çevreleyen yumuşak dokuyu iliak bifurkasyondan aort arkına kadar çıkarın (Şekil 1A). Aort arkının büyük dallarını çevreleyen kalan yağ ve yumuşak dokuyu çıkarın (yani, brakiyosefalik, ortak karotis ve subklavyen arterler, Şekil 1B).
not: Aorttan yağın alınması önemlidir, çünkü floresan görüntüleme yapılırken yağ arka plan sinyalini artırabilir.
- Kalbi göğüs boşluğundan çıkarın, proksimal aorttan dikkatlice ayırın ve atın. Distal aortu iliak bifurkasyonda transekt. Bir insülin iğnesi kullanarak, kalan kan hücrelerini yıkamak için aort kemerinden aort içine normal salin enjekte edin. Aortu aort kemeri damarları ile birlikte vücuttan tamamen çıkararak ayırın.
- Aortu görüntüleme için hazır olana kadar buz üzerinde normal tuzlu su çözeltisine yerleştirin.
3. Primer Murin Aort Vasküler Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu
- Diseksiyonlar tamamlanana kadar aortları soğuk HBSS'ye yerleştirin. Kalan periaortik yağ ve yumuşak dokuyu dikkatlice kesin ve sadece aortu bırakın.
- Steril bir doku kültürü başlığı altında, aortları 35 mm x 10 mm doku kültürü kaplarında Aort Sindirim Solüsyonuna aktarın. 37 ° C'de 30 dakika boyunca hafif aralıklı sallanarak bir inkübatöre yerleştirin. Sindirimden sonra, aortlar gergin veya yıpranmış bir görünüm sergiler.
- Diseksiyon mikroskobu ve steril forsepslerle, medial tabakayı sağlam tutarken aortun dış adventisyel tabakasını çıkarın. Adventitiyi çıkarmak için bir teknik, aortun dış tabakasını bir ucundan soymak ve bir çorap gibi soyulup çıkarılabileceği gibi alttaki medial tabakadan çıkarmaktır.
- Adventisyel tabaka çıkarıldıktan sonra, kalan aortu hücre kültürü ortamı olan yeni bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2-4 saat saklayın.
- Steril bir başlık altında ve steril 3 mm mikro diseksiyon makası kullanarak aortu 1-2 mm genişliğinde halkalar halinde kesin.
- Bu halkaları Aort Sindirim Solüsyonu ile yeni bir doku kültürü kabına yerleştirin ve 37 ° C'de 120 dakika boyunca hafif aralıklı sallanma ile inkübe edin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için bu inkübasyon sırasında solüsyonu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Sindirim çözeltisine 5 ml ılık hücre kültürü ortamı ekleyin ve 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
- Tüpü 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Ortamı aspire edin ve hücreleri istenen hacimde hücre kültürü ortamında (örn., 5 ml).
- Her aorttan izole edilen tüm hücre miktarını 25cm2'lik bir hücre kültürü şişesinde plakalayın ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Daha önce açıklandığı gibi standart teknikler kullanarak hücreleri çoğaltın. Kuluçkanın ilk 7-10 günü boyunca, ortamı her 72-96 saatte bir değiştirin. Hücreler birleşmeye yaklaştıkça, ortamı daha sık yenileyin (her 48 saatte bir).
not: Yeterli miktarda hücrenin büyümesi haftalar alabilir.
- Bir kez birleştiğinde, 37 ° C'ye ısıtılan tripsin ile geçiş hücreleri.
- Her kültür şişesine 0.5-1.0 ml tripsin ekleyin ve 3-5 dakika inkübe edin; hücreleri yüzeyden ayırmak için her 30-60 saniyede bir şişenin kenarına hafifçe vurun.
- Hücreler şişenin dibinden ayrıldıktan sonra, tripsin içindeki hücrelere 10 ml hücre ortamı ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletinden ortamı ve tripsini aspire edin. Hücreleri istenen miktarda taze hücre ortamında (örneğin, 5-10 ml) yeniden süspanse edin ve yeni bir şişeye aktarın (bazı hücreler bir hazne slaytına aktarılarak).
- Hücrelerin ilk geçişinde, düz kas hücresi soyunu, daha önce tarif edildiği gibi, α-düz kas aktinine karşı yönlendirilmiş bir antikor kullanarak standart immünositokimya teknikleriyle doğrulayın.
>4. Kültürlenmiş Düz Kas Hücrelerinin Kalsifikasyonunu İndüklemek
- 3.12'den 6 oyuklu formatta elde edilen plaka hücreleri.
not: Oyuk başına toplam 2.0 ml hücre ortamı hacminde 1 x 105 hücre / kuyu ile başlayarak önerilir.
- Hücrelerin Kalsifikasyon Ortamı A veya B'de en az 7 gün boyunca 6 oyuklu plaka formatında büyümesine izin verin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO 2 ile inkübe edin.
- Hücre ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
5. Von Kossa Boyama Yöntemi Kullanılarak VSMC Kalsifikasyonunun Değerlendirilmesi
NOT: Dokuların veya kültürlenmiş hücrelerin hücre dışı matris kalsifikasyonunu ölçmek için von Kossa yöntemi, fosfata bağlı kalsiyum iyonlarının gümüş iyonları ile ikame edilmesine dayanır. Hafif ve organik bileşiklerin varlığında, gümüş iyonları indirgenir ve metalik gümüş olarak görselleştirilir. Reaksiyona girmemiş herhangi bir gümüş, sodyum tiyosülfat ile muamele edilerek uzaklaştırılır. Von Kossa boyama protokolü aşağıdaki gibidir:
- Hücre kültürü plakalarından aspire ortamı.
- Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 ml% 10 formalin içine yerleştirerek sabitleyin.
- Formalini çıkarın ve sabit hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın.
- Hücreleri 1 ml% 5 gümüş nitrat çözeltisi içinde 60-100 W'lık bir ampul altında 1-2 saat inkübe edin.
- Gümüş nitrat çözeltisini aspire edin ve 5 dakika boyunca damıtılmış su ile yıkayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış suda 1 ml% 5 sodyum tiyosülfat (w / h) çözeltisine yerleştirerek reaksiyona girmemiş gümüşü çıkarın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış su ile durulayın. Yıkamaları 3 kez tekrarlayın. Von Kossa boyası, standart ters çevrilmiş ışık mikroskobu ile görüntülemeye hazırdır.
- İsteğe Bağlı Adım: 5 dakika boyunca 1 ml nükleer hızlı kırmızı ile lekeleyin. Bunu damıtılmış suyla üç yıkama ile takip edin (her biri 5 dakika).
