TEM Izgaraları Üzerinde Virüs Örneklerinin Kapsül Bazlı Negatif Boyanması: Zarflı Virüslerin Üst Yapısını Görselleştirmek İçin Bir Ağır Metal Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Blancett, C. D., et al. Biyo-muhafaza İçinde Viral Örneklerin Negatif Boyanması için Kapsüllerin Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, biyolojik muhafaza ortamında bir işleme kapsülü kullanarak zarflı virüs örneklerinin negatif boyanmasını gösteriyoruz. Negatif lekeli virüsler, viral yapıyı ve morfolojiyi nanometre çözünürlüğünde araştırmak için transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

Protokol

1. %2 Glutaraldehit ile Biyomuhafazada İnaktivasyon için Kapsül Yöntemi ve ardından BSL-2 Laboratuvarında Negatif Boyama

1. Virüs inaktivasyon prosedürü.
   1. Biyo-muhafaza BSC'nin içinde, %2'lik bir nihai glutaraldehit konsantrasyonu elde etmek için virüs süspansiyonunu aynı hacimde %4 glutaraldehit ile iyice karıştırın.
      Dikkat: Gluteraldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve uygun koruma gerektirir. Glutaraldehit, normal bir BSC'de kısa süreler için kullanılabilir, ancak uzun süreli açık reaktif, kanallı bir BSC veya kimyasal davlumbazda çalışmayı gerektirir.
   2. Paketleme, dekontaminasyondan önce virüsleri en az 24 saat fiksatif ile etkisiz hale getirin ve BSL-2 EM tesisine aktarın.
2. BSL-2 EM tesisinde, virüsü ve fiksatif karışımı, bir pipete bağlı iki TEM ızgarası içeren kapsüle aspire edin.
3. Pipeti, ızgaralar yatay olarak yönlendirilecek şekilde 10 dakika boyunca yatay olarak yerleştirin.
   not: Bu, virüs parçacıklarının TEM ızgaralarına eşit dağılımını teşvik etmek içindir.
4. Pipeti alın ve virüsü bir atık kabına atmak için pistona bastırın. Kapsüllere 40 μL dI su aspire edin ve 3 durulama döngüsü için atık kabına atın.
5. 40 μL'lik %1 uranil asetat (UA) veya %1 potasyum fosfotungstik asit (PTA) 30 s.
   için kapsüllere aspire edin not: Boyama süresi virüs örneğine göre 10 saniye ile 1 dakika arasında değişmiştir.
   Dikkat: UA bir alfa yayıcı ve kümülatif bir toksindir. Uygun koruma ile kullanın.
6. Kapsülü pipetten çıkarın ve ızgaraların kenarını bir parça filtre kağıdına dokundurarak ızgaraları kurulayın. Izgaraları havayla kurutun ve sonraki TEM görüntülemesi için saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Formvar/karbon kaplı TEM ızgaraları	Spı	3420C-MB	200 gözlü Cu Pk/100
mPrep/g kapsülleri	EMS	85010-01	kutu
mPrep/f kuplörleri	EMS	85010-11	Standart 16/PK
Glutaraldehdyde	EMS	16320	%50 çözüm, EM sınıfı
Uranil Asetat	EMS	22400	toz
Potasyum fosfotungstik asit	EMS	19500	toz
Filtre kağıdı	Ne adam	1450-090	Boyut 50
Transmisyon Elektron Mikroskobu	JEOL	JEM-1011	Tem