$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Eozin boyama protokolü
- Yumuşak doku örneklerini sabitlemek için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünü 9.5 mL %4 (h/h) formaldehit çözeltisi (FA) ve 0.5 mL buzlu asetik asit (AA) içeren fiksatif bir çözelti ile doldurun.
not: FA solüsyonunu, yaklaşık% 10 metanol ile stabilize edilmiş% 37 asitsiz bir FA solüsyonundan taze olarak hazırlayın. FA çözeltisini Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile daha da seyreltin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'yi seçin. Seyreltik FA çözeltisini bir aydan fazla tutmayın. Asitleştirme sırasında, fiksatif çözeltinin pH'ı nötrden yaklaşık 3.
'ye değişmektedir
Dikkat: FA akut organ toksik, korozif ve kanserojen olduğundan, çeker ocak kullanımı zorunludur ve uygun koruyucu kişisel ekipman kullanılmalıdır.
- Yeni çıkarılmış yumuşak doku örneğini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve 50 mL'lik santrifüj tüpünü 24-72 saat
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
- Yumuşak doku örneğini DPBS solüsyonu ile 1 saat yıkayın.
- Sabitlenmiş yumuşak doku örneğini (örneğin, bütün bir fare böbreği) boyamak için, yumuşak dokuyu 2 mL eozin Y-boyama çözeltisine yerleştirin ve örneği 24 saat inkübe edin. İnkübasyon işlemi sırasında düzgün bir sallanma (yaklaşık 60 rpm) için numuneyi yatay bir sallama plakası üzerinde tutun.
not: Eozin Y-boyama çözeltisi, damıtılmış suda %30 (a/h) konsantrasyona sahiptir. Boyama çözeltisinin hacmini, numune tamamen boyama çözeltisi ile kaplanacak ve numunenin numune kabı içinde serbestçe hareket etmesine izin verecek şekilde seçin. Kuluçka süresi diğer numuneler için farklılık gösterebilir ve buna göre ayarlanmalıdır.
- Boyamadan sonra, yumuşak doku örneğini örnek kabından dikkatlice çıkarın.
- Fazla boyama maddesini selüloz kağıt mendil ile dikkatlice çıkarın.
- Yumuşak doku numunesini, saklama ve daha fazla kullanım için bir etanol buhar fazının üzerinde konik bir numune kabına yerleştirin.
not: Konik numune kabı, yumuşak doku numunesini nemli tutmak ve artefaktları önlemek için tüpün dibinde her zaman birkaç damla %70 (h/h) etanol içermelidir.