$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Boyama solüsyonlarının hazırlanması
- Çökelen katıları uzaklaştırmak için Harris hematoksilen stok çözeltisini filtreleyin.
- Bir kahve filtresini ikiye katlayın, böylece filtre bir koni oluşturur. Yan paneli, sıvının filtreden geçmesi ve herhangi bir kalıntının yakalanmasına izin vermesi için açın.
- Filtreyi bir huninin içine ve huniyi bir cam ortam şişesine yerleştirin. Stok hematoksilini yavaş yavaş filtreden dökün.
Dikkat: Hematoksilen gözle teması, yutulması ve solunması durumunda tehlikelidir. Daima bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin ve stok çözeltisini kimyasal bir başlıkta tutun.
- 250 mL ddH2O'ya 125 μL 12 N HCl ekleyerek% 0.05 HCl hazırlayın.
- 25 mL %1 eozin Y (sulu), 2.5 mL %1 floksin B (sulu), 195 mL %95 etanol ve 1 mL buzlu asetik asidi bir cam şişede birleştirerek eozin Y-floksin B çözeltisi karışımını hazırlayın. Döndürerek iyice karıştırın ve RT
'da saklayın
Dikkat: Eozin Y, göz teması, yutulması ve solunması durumunda tehlikelidir. Daima bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin ve stok çözeltisini kimyasal bir başlıkta tutun.
- 98 mL yumurta suyuna 2 mL saf etil alkol ekleyerek %2 etanol hazırlayın.
Dikkat: Etil alkol gözü tahriş eder. Etil alkolle çalışırken daima uygun koruyucu ekipman giyin. Aynı zamanda yanıcıdır ve buna göre ele alınmalı ve saklanmalıdır.
NOT: Akut etanol işlemini gerçekleştirmeden önce her seferinde taze% 2 etanol hazırlayın.
2. Parafin Bölümlerinin Hematoksilen ve Eozin Boyaması
- Slaytları 15 dakika boyunca% 100 ksilen içine batırarak deparafinize edin; 15 dakika daha taze% 100 ksilen ile değiştirin.
- Slaytları, sıvı slaytlardan temiz bir şekilde akana kadar aşağıdaki kademeli etanol serisine daldırarak yeniden sulandırın. Her çözelti için 8-10 kez, daldırma başına 2 saniye daldırın: %100 etanol, %100 etanol, %95 etanol, %95 etanol, %70 etanol, %50 etanol, %30 etanol ve deiyonize su.
not: Protokol burada durdurulabilir ve slaytlar RT'de birkaç saat suda bırakılabilir. Gerekirse, slaytlar 4 °C'de su O/N'de saklanabilir.
- Slaytları 4 dakika boyunca %100 filtrelenmiş Harris hematoksilen içine yerleştirin. Hemen deiyonize su ile kaba geri aktarın. Deiyonize suyu, bölümlerden en uzaktaki kabın arka köşesine akıtın. Su artık mor olmayana kadar kabı periyodik olarak boşaltın.
not: Bölümler kaydıraklardan çıkabileceğinden, suyun doğrudan kaydırakların üzerine akmasına izin vermeyin.
- Deveboynu ışıkları kullanarak hematoksilen yoğunluğunu diseksiyon mikroskobunda hızlı bir şekilde kontrol edin; slaytların kurumasına izin vermeyin. Leke istenen yoğunluğa ulaştıysa, bir sonraki adıma geçin. Renk yeterince koyu değilse, slaytları 1 dakika boyunca %100 hematoksilen içine yerleştirin ve tekrar kontrol etmeden önce suyla yıkamayı tekrarlayın.
not: Eozin boyaması sırasında rengin kaybolmaması için hematoksilinin yeterince koyu olması gerekir. Bununla birlikte, sitoplazmada hematoksilen lekelenmesi görülürse, bölümler fazla boyanır.
- Slaytları iki kez% 0.05 HCl'ye batırın ve hemen temiz deiyonize su ile kaba geri aktarın. Suyu boşaltın ve kabı iki kez suyla doldurun.
- Slaytları 30 saniye boyunca %95 etanole aktarın ve ardından 30 saniye boyunca %95 etanol içeren yeni bir kaba aktarın.
- Slaytları 2 dakika boyunca eozin Y-Floksin B çözeltisine yerleştirin. Slaytları önceki% 95 etanol kabına geri aktarın ve diseksiyon mikroskobu altında rengin yoğunluğunu hızlı bir şekilde kontrol edin. Boyama yeterliyse, bir sonraki adıma geçin. Değilse, 30 saniye boyunca eozin çözeltisine geri dönün, tekrar kontrol edin ve gerektiği kadar tekrarlayın.
not: Yeterli eozin boyaması parlak pembe renktedir ve hematoksilen boyası ile belirgin bir kontrast oluşturur. Mikroskop altında kontrol ederken slaytların arkasındaki herhangi bir solüsyonu sildiğinizden emin olun, böylece yanlış bir renk gözlenmez. Eozin %95 etanolden oluştuğu için, renk yoğunluğunu kontrol ederken %95 etanolde uzun süre çalışmak rengin bir kısmını sızabilir.
- Slaytları 15 saniye boyunca %100 izopropanole aktarın. Taze %100 izopropanol ile değiştirin ve slaytları 15 saniye daha izopropanol içine geri yerleştirin. Bu işlemi toplam 6 izopropanol yıkaması için tekrarlayın.
Dikkat: İzopropanol göz ve solunum yolu tahriş edicidir. Her zaman uygun koruyucu ekipman giydiğinizden ve su sıçramasını önlediğinizden emin olun. Aynı zamanda son derece yanıcıdır ve buna göre saklanmalı ve kullanılmalıdır.
not: Reaktiflerden tasarruf etmek için yalnızca ilk (en pembe) izopropanol yıkamasını atın. Diğer beş yıkama solüsyonunu, bir sonraki boyama için tekrar kullanılmak üzere 1'den 5'e kadar numaralı şişelerde saklayın. Yıkamaları tekrar kullanırken, "1" numaralı şişeyle başlayın ve kullandıktan sonra atın. "2" yıkandıktan sonra, "1" şişesine dökün ve bu şekilde devam edin. Son yıkama her zaman taze izopropanol olmalıdır.
- Slaytları 3 dakika boyunca %100 ksilenler içine yerleştirin. Her seferinde bir slaytı çıkarın ve bir lamel yerleştirin.
- Bölümleri kaplayacak kadar montaj ortamı ekleyin ve %100 ksilen.
not: Bu adım, montaj ortamının yüzeyini düzleştirecek ve kabarcıkları giderecektir.
- Slaytın altına bir lamel uygulayın.
not: Montaj ortamı sürgüyü yerine çekmelidir. Lamel düz değilse veya tamamen oturmamışsa, yavaşça yerine vurun.
- Fazla montaj ortamını, yalnızca ince bir çizgi görünene kadar bir kağıt havlu üzerine kurulayın. Bir mendil mendilini ksilene batırın ve damlayan herhangi bir ortamı çıkarmak için slaytın arkasını silin. Slaytı bir karton parçası gibi sağlam ancak hareketli bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirin. Kalan tüm slaytları aynı şekilde kaydırın. Ksilenin davlumbazda 10 dk.
buharlaşmasına izin verin
not: Ksilen ile kontamine olmuş herhangi bir malzeme çıkarılmalı ve herhangi bir buharın kaçmasını önlemek için davlumbazdaki kapalı bir kapta atılmalıdır.
- Montaj ortamının RT O/N'de sertleşmesine izin verin.
3. Lekeli Slaytların Görüntülenmesi ve Saklanması
- Bileşik ters çevrilmiş mikroskopta görüntü kesitleri.
not: Slaytlar süresiz olarak oda sıcaklığında tutulabilir.