İn Vitro Metastatik Koloni Oluşumunu Değerlendirmek için Metilen Mavisi Boyama: Kanser Fare Modelinden Hasat Edilen Kanser Hücrelerini Ölçerek Metastazı Değerlendirmek İçin Bir Boyama Prosedürü

Özet

Kaynak: Nagai-Singer, M. A., et al. 4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Niceliğini İyileştirmek için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, enjeksiyonu takiben bir fare modelinin uzak organlarından toplanan kanser hücrelerinin kültürlenmesiyle elde edilen lekeli kolonileri sayarak metastatik yükü ölçmek için metilen mavisi boyama prosedürünü açıklıyoruz.

Protokol

Tüm hayvan modeli prosedürleri, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Dokuların İşlenmesi

>NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar steril teknik kullanılarak yapılmalıdır.

1. Fare başına 1 15 mL konik tüpü etiketleyin ve her tüpe 2,5 mL tip IV kollajenaz karışımı ve 30 birim elastaz ekleyin. Tip IV kollajenaz karışımı yapmak için, mL başına 2 mg tip IV kollajenaz 1x HBSS ve steril filtreyi çözün. Bu, -20 ° C'de 12 aya kadar saklanabilir ve gerektiğinde çözülebilir.
2. Hasat edilen fare akciğerini ikinciye aktarın, bu örnek için 1x HBSS'yi temizleyin. Kalan kanı çıkarmak için forseps kullanarak döndürün. Temiz akciğeri boş 3,5 cm'lik doku kültürü plağına aktarın. Akciğeri makasla kıyın. Plakayı 2,5 mL 1x HBSS ile durulayın, 1x HBSS ve akciğer parçalarını zaten kollajenaz / elastaz kokteyli (toplam 5 mL) içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
3. 4 °C'de 75 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında numuneleri karıştırmaya devam edin, bu nedenle tüpleri bir külbütör veya dönen tekerlek üzerine yerleştirin. Bu inkübasyon adımı sırasında, her fare için 50 mL santrifüj tüplerini ve 10 cm'lik doku kültürü plakalarını etiketleyin. Bir seyreltme yapıyorsanız, seyreltmeler için yeterli 10 cm doku kültürü plakasını etiketleyin.
   not: Doku kültürü plakalarının kapağını etiketleyin. Plakanın kendisi etiketlenirse, yazı Fiji-ImageJ analizine müdahale edecektir.
4. 1x HBSS ile her tüpün hacmini toplam 10 mL'ye getirin. İçeriği 70 μm'lik bir hücre süzgeci üzerine her numune için 50 mL'lik konik bir tüpe dökün. Daha fazla hücrenin süzülmesine izin vermek için numuneyi süzgeçten nazikçe öğütmek için 1 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın.
5. Oda sıcaklığında (RT) 350 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL 1x HBSS ile yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
6. Pelet, RPMI veya IMDM olmak üzere 10 mL 60 μM 6TG tam kültür ortamında yeniden süspanse edilir. İstenirse bir seyreltme şeması kullanılarak 10 cm'lik hücre kültürü plakalarında plaka numuneleri. 37 °C'de, %5 CO_2'de 5 gün inkübe edin.
   NOT: 1:2, 1:10 ve 1:100, çalışma parametrelerine dayalı olarak ampirik olarak belirlenmesi gereken yaygın seyreltmelerdir.
   DİKKAT: 6TG toksiktir. Kullanırken dikkatli olun ve bertaraf için tüm Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine uyun.

2. Boyama plakaları

1. Kültür ortamını plakalardan uygun atık kabına dökün. Plaka başına 5 mL seyreltilmemiş metanol ekleyerek hücreleri sabitleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin, metanolü tüm plakayı kaplayacak şekilde döndürdüğünüzden emin olun.
   Dikkat: Metanol yutulduğunda, solunduğunda veya ciltte olduğu takdirde tehlikelidir. Bu adım için bir çeker ocak kullanın.
2. Plakalardan metanolü uygun atık kabına dökün. Plakaları plaka başına 5 mL damıtılmış su ile durulayın ve suyu uygun atık kabına dökün. Plaka başına 5 mL %0.03 metilen mavisi ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin, metilen mavisi solüsyonunu tüm plakayı kaplayacak şekilde döndürdüğünüzden emin olun.
3. Metilen mavisini uygun atık kabına dökün. Plakaları, plaka başına 5 mL damıtılmış su ile tekrar durulayın. Plakaları ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havluya kurulayın. Plakayı kapağına yerleştirin ve gece boyunca RT.
   not: Metastatik koloniler mavi olacaktır. Plakalar kuruduktan sonra süresiz olarak RT'de saklanabilirler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
metanol	Balıkçı Bilimsel	A412SK-4
Metilen mavisi	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Orta	ATCC (Uzay Servisi)	30-2001
Külbütör veya dönen tekerlek	herhangi	herhangi
PES membranlı steril tek kullanımlık filtre	ThermoFisher Bilimsel	568-0010
Tip IV kollajenaz	Sigma-Aldrich	C5138
3,5 cm doku kültürü plakaları	Rahibe	153066
10 cm doku kültürü plakaları	Balıkçı Bilimsel	08-772-22
15 mL santrifüj tüpü	Balıkçı Bilimsel	14-959-70C
1X Hank'in Dengeli Tuzlu Su Çözeltisi (HBSS)	Termo Bilimsel	SH3026802
50 mL santrifüj tüpü	Balıkçı Bilimsel	14-959-49A
70 μM hücre süzgeci	Balıkçı Bilimsel	22-363-548
% 70 etanol	Sigma Aldrich	E7023	DI su ile% 70'e kadar seyreltin
kuvöz			%5CO2 ve 37 °C kapasitesine sahip olması gerekir
Forseps	Roboz Belediyesi	RS-8100
merkezkaç	herhangi	herhangi	125 x g ve 300 x g kapasitesine sahip olması gerekir
Damıtılmış su	herhangi	herhangi
Elastaz	MP Biyomedikal	100617

Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi · Serisi Serisi