Hücrelerin Periyodik Asit-Schiff Boyama: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde Glikojen Düzeylerini Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tam Kandan PBMC İzolasyonu

NOT: Bu prosedürü, steril teknik ve üretici tarafından sterilize edilmiş ekipman kullanan bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

1. Heparinize (pıhtılaşmayı önleyici) kan alma tüplerinden 10-15 ml tam kanı dikkatlice 50 ml'lik steril konik bir tüpe dökün. Küçük kan dökülmeleri için, temizleme mendili kullanarak ddH₂O ve% 70 EtOH ile silin.
2. Konik tüpteki kanı Fosfat Tampon Salin (PBS 1x) pH 7.4 ile 1: 1 oranında seyreltin. Maksimum toplam hacmin 30 ml'yi geçmediğinden emin olun.
3. Kabarcıkları önleyen serolojik bir pipet tabancası kullanarak nazikçe karıştırın.
   not: Santrifüjleme sırasında kapakta kan birikmesini ve ardından sızıntıyı önlemek için tüpü ters çevirerek KARIŞTIRMAYIN.
4. 50 ml kapasiteli yeni bir konik tüpe 13 ml Ficoll-paque (Malzeme tablosuna bakınız) ekleyin. Tüpü rafta dik tutun.
5. Bir transfer pipeti kullanarak seyreltilmiş kanı alın, transfer pipeti ucunu tüpün üst kısmına yakın iç duvarına dokundurun. Yavaş ve sabit bir basınçla, kanı tüpün iç duvarı boyunca aktarın ve sükroz tabakasının üstünde bir kan tabakası oluşturun. Tüm kan transfer edilene kadar bu adımı birkaç kez yapın.
6. Tüpü sıkıca kapatın ve tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 x g'da, orta ivme 5'e ve yavaşlama SIFIR'a ayarlanmış bir döner rotorda santrifüjleyin.
7. Tüpü yavaşça çıkarın ve katmanları rahatsız etmeden biyogüvenlik kabinine geri götürün.
8. PBMC'lerin bulunduğu buffy kaplamayı (ince bulutlu beyaz tabaka), bir transfer pipeti kullanarak PBS/plazma ve ficoll katmanları arasına dikkatlice toplayın. Sakkaroz tabakasını toplamaktan kaçının ve kırmızı kan hücresi tabakasını rahatsız etmeyin.
9. Buffy kaplamayı 50 ml'lik yeni bir steril konik tüpe aktarın. Tüm PBMC'yi toplamak için adım 1.8'in birkaç kez tekrarlanması gerekebilir.
10. PBMC ile tüpe PBS pH 7.4 ekleyin ve 45 ml işaretine kadar doldurun. Tüpü iyice çalkalayın. Girdap yapmayın.
11. Yıkama 1: Hem maksimum hızlanma hem de yavaşlama 9'a ayarlanmış olarak 480 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Konik borunun dibinde bir PBMC peleti oluşumunu gözlemleyin.
12. PBS'yi (süpernatant) 10 ml çamaşır suyu içeren plastik bir behere atın.
13. Dalgalı bir yüzeye (yani boş raf) hafifçe "raf" yaparak hücre peletini gevşetin. Girdap yapmayın.
14. Tüpe 25 ml taze PBS pH 7.4 ekleyin. Birden fazla tüp işleniyorsa, bu adımda peletleri bir araya getirin.
15. Yıkama 2: Tüpü hem maksimum hızlanma hem de yavaşlama 9'a ayarlanmış olarak 480 x g'da 12 dakika santrifüjleyin.
16. PBS'yi (süpernatant) bir miktar çamaşır suyu ile plastik behere atın.
17. Dalgalı bir yüzeye (yani boş raf) nazikçe "raf" yapın. Girdap yapmayın.
18. Tüpe 25 ml taze PBS ekleyin.
    1. Hücrelerin 50 μl'sini çıkarın ve canlılık sayımı için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Eşit miktarda (50 μl) tripan mavisi (canlılık lekesi) ekleyin ve hafifçe karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
19. 10 μl'yi çıkarın ve ml başına hücrelerin canlılığını kontrol etmek için bir hemositometreye aktarın. Hücre / ml sayısını kaydedin.
20. İstenilen miktarda hücreyi çıkarın ve tüpü hem maksimum hızlanma hem de yavaşlama 9'a ayarlanmış olarak 480 x g'da 12 dakika santrifüjleyin.
21. PBS'yi (süpernatant) çamaşır suyu ile behere atın.
22. Dalgalı bir yüzeye (yani boş raf) nazikçe "raf" yapın. Tüpe 80 μl PBS ekleyin.

2. PBMC Slaytını Oluşturma

1. Hücrelerin 80 μl'sini bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Damlayı başka bir slayt yardımıyla sürün veya sürgünün her iki ucuna 2'şer damla 40 μl yerleştirin.
2. Kuruması için biyolojik güvenlik kabininde sürgüyü bırakın. Slaytı buzlu tarafında bir kalemle etiketleyin.

3. Örneklerin Slaytlara Sabitlenmesi

1. 0.5 ml %37 formaldehit ile 4.5 ml %99 etanol karıştırarak fiksatif çözeltiyi hazırlayın.
2. Slaytlar kuruduktan sonra, taze yapılmış fiksatif solüsyondan 2 ml çıkarın ve slaydın tüm yüzeyi kaplanacak şekilde slaydın üzerine dökün.
3. Solüsyonu 1 dakika slayt üzerinde bırakın. Slaytı 1 dakika musluk suyuyla durulayın ve kurumaya bırakın.

4. Negatif Kontrol için Amilaz Çözeltisinin Yapılması

1. 0.25 g amilaz tozu alın ve 50 ml damıtılmış suda çözün. Solüsyonu 100 ml'lik temiz bir behere dökün.
2. Slaytı, sürgünün yarısı tedavi edilecek ve diğer yarısı tedavi edilmeden kalacak şekilde behere daldırın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin (Şekil 1C).
3. Slaytın hangi tarafının amilaz tedavisi aldığına dikkat edin. Slaytın arkasına, tedavi ve kontrol arasındaki sınırı gösteren bir çizgi çizin.
4. Amilaz çözeltisini çıkarmak için slaytları ddH₂O ile yıkayın ve slaytı kurumaya bırakın.

5. Periyodik Asit Schiff (PAS) Boyama ve Görüntüleme Gerçekleştirin

>NOT: PAS reaktifleri solunduğunda toksiktir ve aşındırıcıdır, bu nedenle adımların kimyasal bir çeker ocakta yapılması ve atık ürünlerin kurumsal yönergelere göre uygun şekilde imha edilmesi gerekir.

1. Slaytı düz bir yüzeye yerleştirin ve numunenin üzerine 1.50-2.00 ml Periyodik Asit Çözeltisi dökün. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
2. Slaytları birkaç kez damıtılmış su ile durulayın.
3. Slaytın üzerine 1.50-2.00 ml Schiff reaktifi dökün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
4. Slaytı 5 dakika damıtılmış suyla yıkayın ve kurumaya bırakın.
5. Sürgü üzerine 10 μl montaj ortamı uygulayın ve iki küçük lamel ile kapatın veya 50 μl uygulayın ve bir büyük lamel kullanın.
6. Lamelin kenarlarına şeffaf oje sürün, gece boyunca kurumaya bırakın.

>6. 100X Objektifini Kullanarak Binoküler Işık Mikroskobu ile Görüntü Elde Edin

Şekil 1: PBMC'de PAS boyamanın adım adım metodolojisi.(A) İlk olarak, PBMC'nin izolasyonu ficoll gradyanı ile sağlanır, sol panel santrifüjleme öncesi hazırlığı gösterir, sağ panel santrifüjlemeden sonra gösterir, burada PBMC'yi içeren buffy coat tüpün merkezinde gözlenir. (B) İzole edilmiş PBMC'ler, formalin-etanol fiksatif çözeltisi kullanılarak slayt üzerine sabitlenir. Sürgü, plastik bir yıkama şişesinden damıtılmış su ile nazikçe durulanır. (C) Slayt daha sonra glikojeni çözecek olan amilaz çözeltisi ile yarıya kadar doldurulmuş 100 ml'lik bir behere yerleştirilir. Slayt nazikçe durulanır. (D) Slayt, sakkaritlerin oksidasyonunun gerçekleştiği periyodik asit çözeltisi ile muamele edilir. Slaytlar nazikçe durulanır; Bu, fazla periyodik asidi uzaklaştıracak ve oksidasyon adımını durduracaktır. (E) Schiff reaktifi slaytlara eklendiğinde, oksidasyon aşaması sırasında oluşan aldehitlerle reaksiyona girecektir. Bu renksiz reaktif daha sonra koyu kırmızı macenta bir ürünle sonuçlanacaktır. Fazla Schiff reaktifini çıkarmak için slaytlar nazikçe durulanır.