Kristal Menekşe Boyama: Koloni Oluşumu Deneylerini Kullanarak İlaca Dirençli Kanser Hücrelerini Görselleştirme Tekniği

Özet

Kaynak: Mohr, L. ve ark., Anti-mitotik Ajan Dosetaksele Direnç Prostat Kanseri Hücre Modellerinin Oluşturulması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, kemoterapötik ilaca dirençli kanser hücreleri için kristal viyole boyama prosedürü kullanan bir hücre canlılığı testi gösteriyoruz.

Protokol

1. Koloni Oluşum Testi ile Edinilmiş Dosetaksel Direncinin Fonksiyonel Karakterizasyonu

NOT: Bu protokolde kemorezistans koloni oluşum testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılan alternatif yöntemler (yani, MTS tahlilleri) araştırmacıların tercihlerine göre kullanılabilir.

1. Plaka 2,000 hücre (DU145 veya 22Rv1, hem ebeveyn hem de Dosetaksel dirençli) 6 oyuklu plakalarda, oyuk başına 2 mL ortam kullanarak.
2. 24 saat sonra, artan konsantrasyonlarda Docetaxel ekleyin (ebeveyn hücreleri: 0.25, 0.5, 1, 2.5 ve 5 nM; DR hücreleri: 50, 125, 250, 500 ve 1.000 nM) hem DU145 hem de 22Rv1 hücre hatları için. DMSO'yu yalnızca bir kuyucuğa ve en yüksek Docetaxel dozu için kullanılan aynı hacimde bir kontrole ekleyin.
3. 72 saat sonra, ilaç içeren besiyerini aspire edin ve taze Dosetaksel içermeyen besiyeri ekleyin.
4. Koloniler mikroskop altında görünene kadar plakaları 1-2 hafta inkübe edin.
5. Kolonileri lekelemek için, 2-3 mL PBS ile nazikçe yıkayın ve doku kültürü başlığı veya çeker ocak içinde 20 dakika boyunca 2-3 mL kristal viyole solüsyonu (% 10 formalin içinde% 0.1 w / v) ile inkübe edin.
6. Boyama solüsyonunu çıkarın ve plakaları 2-3 mL H₂O ile yıkayın, H₂O'yu çıkarın ve havayla kurutun.
7. Kuyucukları görselleştirerek ve bir işaretleyici kalem yardımıyla kolonileri manuel olarak sayarak (aynı kolonileri iki kez saymaktan kaçınmak için) sonucu analiz edin ve bir grafikte hücre canlılığının yüzdesini temsil edin. Şekil gösterimi için plakaların dijital görüntülerini alın (Şekil 1).

Sonuçlar

Şekil 1: Dosetaksele dirençli hücre modellerinin fonksiyonel ve fenotipik karakterizasyonu. 72 saat boyunca belirtilen Docetaxel konsantrasyonları ile muamele edilen ebeveyn ve Docetaxel'e dirençli hücrelerin temsili koloni oluşum testleri. Her tedavi konsantrasyonu için kolonilerin yüzdesi dahil edilen grafikte temsil edilmektedir. Deneyler üç katlıdır ve veriler SD ± ortalamayı temsil eder. Ölçek çubukları = 5 mm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DU145 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-81
22Rv1 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2505
Dosetaksel	Selleck Kimyasalları	S1148 Serisi	DMSO'da (10mM)
6 oyuklu doku kültürü plakaları	doğan	353046
RPMI 1640 Orta	Gibco (Gibco)	11875093	%10 FBS ve %1 Penicilin/Streptomisin ile desteklenmiştir
Fondöten B Fetal Sığır Serumu	Gemini	900208
1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Corning	21-040-CM
Kristal Menekşe	Sigma-Aldrich	C0775
% 10 Formalin Çözeltisi	Sigma-Aldrich	HT501128

Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi