$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Jelin Hazırlanması
- SDS-PAGE'i %4 - %12 Bis-Tris protein jelleri (1 mm, 15 oyuklu) ile 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponu ile doldurulmuş bir mini jel tankı kullanarak gerçekleştirin.
- Numuneleri damıtılmış su, lityum dodesil sülfat (LDS) tamponu ve numune indirgeyici madde karışımı ile seyreltin.
- İlk şeridi iki kat daha fazla stok (10 μL), ardından normal stok miktarı (5 μL) ve ardından stoğun bir dizi iki kat seyreltmesi (13 seyreltme, 2x'ten 8192x'e kadar) ile yükleyin.
- Jeli 30 dakika boyunca 200 V'luk sabit bir voltajda çalıştırın.
2. Jelin Fiksasyonu
- Elektroforezden sonra, jelleri 100 mL'lik bir %40 etanol/%10 asetik asit çözeltisine 50 rpm'de 2x oda sıcaklığında (her biri 30 dakika) veya gece boyunca 4 °C'de bir orbital çalkalayıcı üzerine daldırın.
- Jelleri her biri 3 x 10 dakika temiz bir kapta ultra saf suda yıkayın. Yıkama aşaması kritiktir. Sabitleme çözeltisinden gelen asit, florojenik geliştirme aşamasında düzgün bir şekilde uzaklaştırılmazsa, aşırı TPE-4TA asit tarafından aktive edilecek ve jelde güçlü arka plan floresansına yol açacaktır.
3. AgNO3 Çözeltisinin Hazırlanması ve Jelin Gümüş Emprenye Edilmesi
- Emprenye için AgNO3 çözeltisini (% 0.0001) yapmak için, önce% 0.1 AgNO 3 stok çözeltisi hazırlamak için 10 mL ultra saf su içinde 0.01 g AgNO3'ü çözün. Daha sonra, çalışma solüsyonunu elde etmek için 100 mL ultra saf suya 100 μL% 0.1 AgNO3 stok çözeltisi ekleyin.
not: AgNO3 çözeltisi kullanılmadan önce karanlıkta saklanmalıdır.
- Jeli, kapalı bir cam kap içinde 50 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca 100 mL gümüş işleme solüsyonu ile emprenye edin. Gümüş emprenye işleminin, alüminyum folyo ile ışıktan korunan bir çeker ocak altında yapılması çok önemlidir.
- Jeli ultra saf suyla (yaklaşık 100 mL) temiz bir kapta 2 x 60 saniye yıkayın.
4. Jelin Florojenik Gelişimi
- Boya stok çözeltisini (0.1 mM) hazırlamak için, 50 mL ultra saf suya 3.0 mg TPE-4TA boyası ekleyin. Çözeltiyi birkaç dakika boyunca sonikate edin ve boyanın çözülmesine yardımcı olmak için bir miktar NaOH çözeltisi (örneğin 1 M) ekleyin.
- Boya molekülünün tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltinin floresansını 365 nm UV lambası altında kontrol edin. Sadece zayıf veya yayıcı olmayan çözeltiler tam çözünmeyi gösterir.
not: TPE-4TA boyası, Xie ve arkadaşları tarafından yakın zamanda bildirilen protokolü takiben sentezlendi.TPE-4TA çözeltisi çok kararlıdır ve aylarca karanlıkta tutulabilir.
- 100 mL florojenik geliştirici çözelti (10 μM) hazırlamak için, 90 mL ultra saf suya 10 mL TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin. Bir pH metre kullanarak çözeltinin pH'ını kontrol edin ve bir sodyum hidroksit çözeltisi (1 μM) kullanarak 7 - 9'a ayarlayın.
- Jeli, 100 mL florojenik geliştirici solüsyon içeren temiz ve sızdırmaz bir kaba aktarın. Jelin solüsyona tamamen daldırıldığından emin olun. Kabı kapatın. Işıktan koruyun ve gece boyunca oda sıcaklığında 50 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sallayın. Alternatif olarak, inkübasyon adımı, AIE geliştirme solüsyonunun boyama için 80 ° C'ye önceden ısıtılması ve ardından oda sıcaklığında bırakılmasıyla yaklaşık ~ 2 saate kadar kısaltılabilir.
5. Leke Çıkarma ve Görüntüleme
- Jeli temiz bir kaba aktarın ve 100 mL% 10 etanol içinde 30 dakika boyunca lekeden arındırın.
not: Jeli yıkamak için tek başına su kullanılabilir. Bununla birlikte, leke giderme için %10'luk bir etanol çözeltisi kullanmak zaman açısından daha verimlidir. Bu, leke çıkarma işlemini saatlerden 30 dakikaya düşürmeye yardımcı olacaktır.
- Jeli ultra saf suda 5 dakika durulayın.
- Jeli bir jel dokümantasyon makinesi ile 365 nm kanalında veya 302 nm kanalında görüntüleyin.