Larva Drosophila Oenositlerinin Lipid Damlacık Boyaması: BODİPY Bazlı Boya Kullanılarak Normal ve Stresli Koşullarda Lipid Damlacık Birikiminin Değerlendirilmesi İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Wei, C., et al., Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, lipofilik floresan BODIPY bazlı boya kullanılarak Drosophila larva oenositlerinde (hepatosit benzeri hücreler) lipid damlacık lekelenmesini göstermektedir. Bu hücreler, gelişim sırasında ve açlık gibi çevresel strese yanıt olarak lipid metabolizmasını incelemek için bir model görevi görür.

Protokol

1. Larvalar için açlık tedavisi

>NOT: Üçüncü instar larvalarında, normal beslenme koşulları altında oenositlerde çok az saptanabilir lipid damlacığı vardır veya hiç yoktur, ancak açlık gibi stres koşulları altında oenositlerde çok sayıda büyük lipid damlacığı indüklenebilir. Bu yöntemi daha fazla doğrulamak için, oenositlerde lipid damlacık biyogenezini indüklemek için bu larvaları ön işleme tabi tutmak gerekir. Burada, paradigma olarak 12 saat, 24 saat ve 36 saatlik bir açlık süresi kursu seçilmiştir. Özellikle, kısa bir açlık süresi (ör., 3 saat) oenositlerde saptanabilir lipid damlacıklarını indüklemek için yeterlidir. Açlık süresi, belirli deneysel hedeflere ve ortamlara göre değişebilir.

1. Açlık ve kontrol tedavileri için odalar yapın.
   1. Açlık tedavi odaları için: 6 cm'lik bir Petri kabına uygun boyutta bir filtre kağıdı yerleştirin ve filtre kağıdına 1 mL PBS pipetleyin.
   2. Kontrol tedavi odaları için: Petri kabına 5 mL Bloomington standart mısır unu yemi koyun.
2. Hala yiyeceğin içinde yuva yapan larvaları içeren yiyeceğin üst tabakasını nazikçe kazmak için bir spatula kullanın ve bunları 5 mL PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Larvalardan herhangi bir gıda kontaminasyonunu gidermek ve mümkün olduğunca temiz hale getirmek için larvaları PBS'de hafifçe karıştırın.
3. Aynı yaklaşık boyutta 40 üçüncü instar larvasını toplamak için küçük bir boya fırçası kullanın. Onları rastgele her biri 20 larva olacak şekilde bir açlık veya kontrol odasına sıralayın.
4. Hazneleri 25 °C'de %60 nemle inkübatöre yerleştirin ve 12 saat, 24 saat ve 36 saat tedavi için gelişime izin verin.
   NOT: Açlık odasındaki larvalar için, larvaların dehidrasyonunu önlemek için her 12 saatte bir 1 mL PBS ekleyin.

2. Oenositlerin diseksiyonu

1. Uygun yaştaki larvaları toplamak için küçük bir boya fırçası kullanın (tedaviden 12 saat, 24 saat veya 36 saat sonra), ardından yıkamak için 5 mL buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın.
   NOT: Herhangi bir gıda kontaminasyonunu gidermek için bir kontrol odasında larvalarla uğraşırken adım 2.2'yi tekrarlayın.
2. Bir diseksiyon plakasını buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve larvaları nazikçe diseksiyon plakasına aktarmak için forseps kullanın. Aşağıdaki diseksiyon adımı için diseksiyon plakasını stereo mikroskop altına koyun.
   NOT: Buz gibi soğuk sıcaklık, larvaların hareketlerini yavaşlatmaya ve diseksiyonu kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
3. Larvaları ventral tarafı yukarı ve sırt tarafı aşağı çevirin ve forseps kullanarak nazikçe yerinde tutun. Ön uçta farenks boyunca bir diseksiyon pimi ve arka uçta spiracle boyunca başka bir pim yerleştirerek larvaları diseksiyon plakasına sabitleyin.
   NOT: Dorsal taraf, trakeanın dorsal gövdelerinin varlığı ile en kolay şekilde tanımlanır.
4. Epidermisi ön uçtan arka uca kadar kesmek (uzunlamasına) için Vannas yaylı makas kullanın.
5. Forseps kullanarak epidermisin iç dokusunu çıkarın.
   NOT: Epidermisin iç yüzeyinde lokalize olan oenositlere zarar vermemek için trakeal dalları çıkarırken dikkatli olunmalıdır.
6. Forseps ile diseksiyon pimlerini alın ve epidermisi buz üzerinde PBS ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
7. Yukarıda açıklanan prosedürü izleyerek diğer larvaları incelemeye devam edin.

3. Lipid Damlacık Boyama

1. Diseke epidermisi fiksasyon tamponunda 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
   not: Fiksasyon tamponu, PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) içerir.
2. Sabitleme tamponunu çıkarın, ardından hızlı bir yıkama yapın. Hızlı bir yıkama yapmak için, PFA'nın çıkarılmasından sonra tüpe RT'de 1 mL PBS ekleyin, dokuları nazikçe yeniden süspanse edin ve PBS.
   atın Dikkat: Sabitleme tamponu, insan sağlığına zararlı PFA içerir. Sabitleme tamponunun tehlikeli atık olarak uygun şekilde atılması önemlidir.
3. Olası tüm PFA kalıntılarını yıkamak için numuneleri 3 kez 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın.
4. Epidermisi BODIPY 493/503 (1 μg/mL; malzeme tablosuna bakınız) ile RT'de bir döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin.
   not: Bu adımdan itibaren, numuneleri ışıktan korumak ve olası foto-ağartmayı en aza indirmek için mikrosantrifüj tüpünü bir parça alüminyum folyo ile sarın.
5. BODIPY 493/503 boyama solüsyonunu çıkarın ve kalan boyaları tamamen çıkarmak için numuneleri 3 kez 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın.

4. Montaj ve Görüntüleme

1. 6 μL montaj ortamını temiz bir mikroskop lamına yerleştirin.
   not: Montaj ortamı, antifade özelliklerine bağlı olarak daha uzun algılama süresi için kullanılır.
2. Bir epidermisi almak için forseps kullanın ve kalan PBS'yi bir mendille nazikçe çıkarın.
3. Epidermisi montaj ortamına yerleştirin ve yönünü, oenositleri içeren iç yüzeyi altta ve dış yüzeyi üstte olacak şekilde ayarlayın.
4. Epidermisin üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin.
   not: Gerekirse lamel altından sızan ekstra montaj malzemelerini bir mendille çıkarın. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için, lamel üzerinde forseps ile hafifçe aşağı doğru bastırın, böylece slaytı mikroskopta gözlemlerken, oenosit kümesi tek bir düzlemde kolayca görüntülenebilir. Alternatif olarak, dokuları monte ederken tüm epidermisin yuvarlanmasını önlemek için epidermisi orta hat boyunca iki yarı epidermise kesmek uygulanabilir.
5. Kapatmak için lamel kenarlarına şeffaf oje sürün.
6. Slaytları ışık geçirmez bir numune kutusuna koyun ve ojenin RT'de kurumasını bekleyin, bu 5-10 dakika sürebilir.
7. Mikroskobik analize devam edin. En aza indirilmiş arka plana sahip temiz ve hassas sinyaller elde etmek için konfokal bir mikroskop (optimize edilmiş GFP veya FITC filtre ayarlarıyla 63x büyütme, uyarma = 488 nm, emisyon = 503 nm) kullanarak görüntü alın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
50 mL santrifüj tüpü	Corning	430829	50 mL
6 cm Petri kabı	Termo Balıkçı	150326	6 cm
Ağar			Sinek yemi için
Alüminyum folyo	Yok	Yok	Sample'ı ışıktan koruyun
BODIPY 493/503	Canlandırıcı	D3922	Lipid damlacık boyama boyası
Konfokal mikroskop	Leica Belediyesi	Leica TSC SP5	Konfokal görüntüleme
Mısır şurubu			Sinek yemi için
Mısır unu			Sinek yemi için
Lamel	Citoglas Belediyesi	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 kalınlık
Diseksiyon pimi	Yok	Yok
Diseksiyon plakası	Yok	Yok
Filtre kağıdı	Yok	Yok	Çap: 11 cm
Fiksasyon tamponu	Yok	Yok	1x içinde %4 Paraformaldehit (PFA) Pbs
Forcep	Dumont	11252-30	#5
kuvöz	Jiangnan Belediyesi	SPX-380	Sinek kültürü için
Mikrosantrifüj tüpü	Aksiyen	MCT-150-C	1,5 mL
Mikroskopi slaytı	Citoglas Belediyesi	10127105P-G
Montaj ortamı	VECTASHIELDAntifade Montajı Orta	H-1000	Antifade montaj ortamı
oje	PanEra (Yatay Geçiş)	AAPR419	Lameli kapatın
Paintbrush	Yok	Yok
Pbs	Yok	Yok	1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na_{2} HPO_{4} ,1,8 mM KH_{2} PO_{4} , pH 7.4)
Rotator	Kylin-Bell Laboratuvar Cihazları	WH-986 Serisi
makasla kesmek	Smartdata Medikal	SR81	Vannas yaylı makas
Soya unu			Sinek yemi için
spatula	Yok	Yok
Standart mısır unu yemeği	Yok	Yok	Bloomington standardı Mısır unu yemek tarifi
Stereo mikroskop	Leica Belediyesi	Leica S6E	Doku diseksiyonu için
Kağıdı silin	Yok	Yok
maya			Sinek yemi için

Serisi Serisi Serisi Serisi