$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. LCO Boyama Çözeltisi
NOT: hFTAA ticari bir satıcıdan satın alınmışsa, lütfen bölüm 1 yerine satıcının talimatlarını izleyin.
- 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için liyofilize hFTAA'yı 2 mM NaOH içinde yeniden süspanse edin. Stoku 4 °C'de bir cam şişede saklayın. Stok bir yıl süreyle saklanabilir.
- Boyama gününde, stoğu 1:10.000 oranında Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyrelterek bir çalışma solüsyonu hazırlayın.
2. Doku Örneklerinin Hazırlanması
NOT: Birçok doku tipi, amiloid belirteci olarak hFTAA kullanılarak görüntülenebilir. Örnekler için Şekil 1'e bakın. hFTAA, agrega konformasyonuna duyarlıdır. Bu nedenle boyama, tercihen epitop maruziyeti olmayan bozulmamış agregalar üzerinde yapılmalıdır. Doku fiksasyonu minimumda tutulursa optimal spektral kalite elde edilir. Bu nedenle, boyama sırasında etanol içinde nazikçe sabitlenmiş taze donmuş malzeme tercih edilir. Bununla birlikte, örneğin formalin ile sabitlenmiş dokuda da amiloid birikintilerini tespit etmek mümkündür. hFTAA genellikle dokuya iyi nüfuz eder. Amaçlanan görüntüleme tekniği ile uyumlu bir numune kalınlığı seçin.
- Formalinle sabitlenmişse, parafine gömülü bölümler kullanılır, gece boyunca ksilen içinde deparafinleştirilir. Bölümleri, her birinde 10 dakika olacak şekilde ardışık %99 etanol, %70 etanol, dH2O ve PBS banyolarına batırın. Doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasına izin verin. Dikkat: Ksilen her zaman kimyasal bir davlumbazda kullanılır. Ksilen ve diğer organik çözücüler zararlıdır.
- Kriyoseksiyonları oda sıcaklığında çözdürün. Doku bölümlerini gece boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin ve her birinde 10 dakika olmak üzere% 99 etanol,% 70 etanol,% dH2O ve PBS ardışık banyolarına batırarak rehidre edin. Doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasına izin verin.
- Kaplamak için doku bölümlerine hFTAA çalışma çözeltisinin damlacıklarını (yaklaşık 200 μL) ekleyin. Damlacık, yüzey gerilimi ile yerinde kalmalıdır. Boyama için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Boyama solüsyonunu bir pipet kullanarak 500 μL PBS ile durulayın ve ardından slaytı 10 dakika PBS banyosuna daldırın. Bölümün ortam koşullarında kurumasını bekleyin.
- Floresan montaj ortamını kullanarak monte edin. Montaj ortamının gece boyunca oturmasına izin verin.
NOT: hFTAA boyama, immünofloresan, hücre veya organele özgü belirteçler vb. gibi diğer boyama yöntemleriyle kombinasyon halinde gerçekleştirilebilir. Birlikte boyama yapmak için, tercih ettiğiniz tam boyama protokolünü çalıştırın ve adım 2.2'den başlayarak sonuna hFTAA boyaması ekleyin. Örnekler için Şekil 2'ye bakın. İmmünofloresan için, tercihen 640 nm veya daha yüksek sıcaklıkta uyarılan ikincil bir antikor seçin. Bu dalga boyu aralığında, hFTAA emilmez ve bu nedenle uyarılamaz ve floresan yaymaz. Bu, hFTAA ile antikor arasında kanama görülmemesini sağlar.
