Tartarat Dirençli Asit Fosfataz Boyama: TRAP Enzimi İçeren Kültürlenmiş Osteoklastları Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Dai, Q., et al. mTORC1'in osteoklast oluşumundaki rolünü araştırmak için fare kemik iliğinin RANKL tabanlı osteoklast kültürü testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, osteoklastların içindeki TRAP içeren granüllerin varlığını tespit etmek için tartarat dirençli asit fosfataz boyama tekniğini göstermektedir. Teknik, osteoklastların sitoplazmasında macenta renkli boya granül birikintileri oluşturur ve bunları ters çevrilmiş bir mikroskop altında görünür hale getirir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Osteoklasta özgü Raptor delesyon fareleri oluşturun (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, bundan böyle Rap^Ctsk olarak anılacaktır) Raptor^fl/fl farelerini Ctsk-cre fareleriyle çiftleştirerek. Bu çalışmada Raptor^{fl / fl} farelerini WT kontrolü olarak kullanın.
2. İzole edilmiş kemiği tutmak için buzlu bir kap bulundurun.
3. Kültür ortamını hazırlayın.
   1. Minimum esansiyel orta alfa (α-MEM) 1x glutamin, penisilin-streptomisin ve% 10 fetal buzağı serumu ile takviye ederek α-MEM kültür ortamını hazırlayın.
   2. 50 mL α-MEM ortamı ve 20 ng / mL'de M-CSF'den oluşan kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı hazırlayın.
   3. 50 mL α-MEM ortamında sırasıyla 20 ng / mL'de M-CSF ve RANKL'den oluşan osteoklast indüksiyon ortamını hazırlayın.
4. TRAP boyamadan önce aşağıdaki tamponları hazırlayın.
   1. 6.5 mL aseton, 2.5 mL sitrat çözeltisi ve 0.8 mL %37 (hacim/hacim) formaldehit çözeltisinden oluşan fiks çözeltisi hazırlayın.
   2. TRAP boyama solüsyonu hazırlayın.
      1. Deiyonize suyu 37 °C'ye ısıtın.
      2. 1.5 mL'lik bir mikrotüpe 100 μL hızlı granat GBC baz çözeltisi ve 100 μL sodyum nitrit çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Karışımı 2 dakika bekletin.
      3. 9 mL deiyonize suyu 37 °C'ye önceden ısıtın. Adım 1.4.2.2'den 200 μL diazotize hızlı granat GBC baz çözeltisi, 100 μL naftol AS-BI fosfat çözeltisi, 400 μL asetat çözeltisi ve 200 μL tartrat çözeltisi ekleyin.
      4. TRAP boyama karışımı solüsyonunu 37 °C'de bir su banyosunda saklayın.

2. Diseksiyon (Gün-1)

1. 3 adet bir aylık dişi WT ve Rap^Ctsk farelerini CO₂ ile ayrı ayrı ötenazi yapın. Eğitimli personel tarafından uygun ekipmanla CO₂ inhalasyonu gerçekleştirin.
2. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için 6 fareyi 100 mL% 75 etanol (hacim / hacim) içeren bir behere 5 dakika daldırın ve ardından sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Tibianın distalinde dikey olarak bir kesi yapın ve cildi arka bacak boyunca oftalmik makasla inceleyin.
3. Kalça ekleminin eklem bağını makasla kesin ve arka bacakları gövdeden çıkarın.
4. Diz ekleminin eklem bağını kesin ve tibia ve uyluk kemiğini diz ekleminden dikkatlice ayırın. Yumuşak dokuyu makasla nazikçe çıkarın.
5. Bir genotipin tüm kemiklerini, buz üzerinde 2 mL α-MEM bulunan altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir farenin içine yerleştirin.
   not: Hücre canlılığını korumak için, kemik bu koşullarda 1 saatten daha az tutulmalıdır.

3. İzolasyon (Gün-1)

1. Altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu% 75 etanol (3 mL) ve diğer 5 kuyucuğu α-MEM ortamı (3 mL) ile doldurun.
2. Bir genotipin tüm kemiklerini etanole koyun, 15 saniye yıkayın ve kemikleri her seferinde 10 saniye boyunca α-MEM ortamı ile 5 kez yıkayın.
3. Epifizleri makasla kesin ve kemik boşluğuna 0,45 mm'lik bir şırınga iğnesi sokun ve iliği α-MEM besiyeri ile 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne akıtın.
4. Kemiğin diğer ucundan aynı yöntemi kullanarak kemik boşluğunu yıkayın. Kemik soluklaşana kadar kemik boşluğunu iyice yıkamak için en az iki kez tekrarlayın.
5. 800 x g ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir hücre peleti elde etmek için kemik iliğini santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin.
6. Santrifüj tüpüne 3 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve kemik iliğini yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için santrifüj tüpünü 8 dakika buz üzerinde tutun.
7. Hücre lizizini durdurmak için santrifüj tüpüne 6 mL α-MEM ortamı ekleyin. 500 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
8. 3 mL α-MEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri altı oyuklu bir plakaya yerleştirin (genellikle oyuk başına bir fare).
9. Gece boyunca %5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.

>4. Kaplama (Gün 0)

1. Ertesi sabah bağlanmamış hücreleri toplamak için süpernatanı 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
2. 800 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
3. 4 mL α-MEM kültür ortamında tekrar süspansiyon
haline getirin.
4. 20 μL hücre çözeltisi alın ve 20 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Sayım odasına 10 μL karışım ekleyin ve mL çözelti başına hücre sayısını elde edin.
5. 500.000 hücre / mL'lik bir hücre çözeltisi elde etmek için uygun hacimde α-MEM kültür ortamı ekleyin.
6. Sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 μL ve 50 μL kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı ekleyin.
7. Sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 μL ve 50 μL hücre çözeltisi ekleyin.
8. 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde 3 gün inkübe edin.

5. Farklılaşma (3-7. Gün)

1. Kaplamadan üç gün sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 μL ortam toplayın ve -20 °C'de dondurun ve ardından kalan ortamı aspire edin.
2. Sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL ve 100 μL osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin.
3. 37 °C'de 2 gün inkübe edin.
4. Her oyuktan 50 μL ortam toplayın ve kalan ortamı aspire edin.
5. Her kuyucuğa osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin.
6. 37 °C'de 1 gün inkübe edin.
   not: Bu zaman noktasında, büyük, çok çekirdekli osteoklastlar ters mikroskop altında görülmelidir (Şekil 1A).
7. Osteoklastlar görülmezse, osteoklast indüksiyon ortamını değiştirin ve osteoklastlar görülene kadar günlük olarak gözlemleyin.
8. Osteoklastlar oluştuktan sonra 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 μL ortam toplayın.

>6. Tartarat Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) Boyama

NOT: Olgun osteoklastlar 6-7 günlük in vitro kültürden sonra mevcut olabilir (adım 4).

1. Ortamı aspire edin ve 1x PBS ile 3 kez nazikçe yıkayın.
2. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 100 μL sabitleme çözeltisi ile sabitleyin.
3. Fiksasyondan sonra, sabitleme solüsyonunu aspire edin ve önceden 37 ° C'ye ısıtılmış deiyonize su ile 3 kez nazikçe yıkayın. Deiyonize suyu aspire edin.
4. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL TRAP boyası ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun.
5. Boyamadan sonra TRAP lekesini aspire edin ve deiyonize su ile 3 kez nazikçe yıkayın.
6. 40X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak osteoklastları görüntüleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Osteoklastların temsili görünümü.(A) 6. günde parlak alanda gözlenen dev osteoklastlar. Kırmızı çizgi, osteoklastların sınırını belirledi. (B) Tipik olarak dev, çok çekirdekli, TRAP pozitif (şarap kırmızısı) bir osteoklast. Siyah ok, çok çekirdekli osteoklastın iki çekirdeğini gösterdi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Raptorfl/fl fareler	Jackson Laboratuvarı	13188
Ctsk-cre fareler			S. Kato'dan bir hediye, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penisilin streptomisin	Gibico	15140122
Fetal baldır serumu	Biyoind	04-001-1A
Rekombinant fare M-CSF proteini	AR-GE	Q3U4F9
Rekombinant fare RANKL proteini	AR-GE	Q3TWY5
RBC lizis tamponu	Beyotime	C3702
Tripan mavisi	Sigma-Aldrich	302643
aseton	Şangay Kimya Co., Ltd.
Sitrat çözeltisi	Sigma-Aldrich	915
Formaldehit çözeltisi	Şangay Kimya Co., Ltd.
Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Hızlı Garnet GBC Base çözümü	Sigma-Aldrich	3872
Sodyum Nitrit Çözeltisi	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Fosfat Çözeltisi	Sigma-Aldrich	3871
Asetat çözeltisi	Sigma-Aldrich	3863
Tartarat çözeltisi	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu	Corning	21-031-CVR
% 37 formaldehit	Xilong bilimsel
IX71	Olympus
0,45 mm Şırınga
makasla kesmek
Sivrisinek forsep

Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi adet Serisi