Tartarat Dirençli Asit Fosfataz Boyama: TRAP Enzimi İçeren Kültürlenmiş Osteoklastları Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Dai, Q., et al. mTORC1'in osteoklast oluşumundaki rolünü araştırmak için fare kemik iliğinin RANKL tabanlı osteoklast kültürü testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, osteoklastların içindeki TRAP içeren granüllerin varlığını tespit etmek için tartarat dirençli asit fosfataz boyama tekniğini göstermektedir. Teknik, osteoklastların sitoplazmasında macenta renkli boya granül birikintileri oluşturur ve bunları ters çevrilmiş bir mikroskop altında görünür hale getirir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Osteoklasta özgü Raptor delesyon fareleri oluşturun (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, bundan böyle Rap^Ctsk olarak anılacaktır) Raptor^fl/fl farelerini Ctsk-cre fareleriyle çiftleştirerek. Bu çalışmada Raptor^{fl / fl} farelerini WT kontrolü olarak kullanın.
2. İzole edilmiş kemiği tutmak için buzlu bir kap bulundurun.
3. Kültür ortamını hazırl....

Sonuçlar

Şekil 1: Osteoklastların temsili görünümü.(A) 6. günde parlak alanda gözlenen dev osteoklastlar. Kırmızı çizgi, osteoklastların sınırını belirledi. (B) Tipik olarak dev, çok çekirdekli, TRAP pozitif (şarap kırmızısı) bir osteoklast. Siyah ok, çok çekirdekli osteoklastın iki çekirdeğini gösterdi.

....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Raptorfl/fl fareler	Jackson Laboratuvarı	13188
Ctsk-cre fareler			S. Kato'dan bir hediye, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penisilin streptomisin	Gibico	15140122
Fetal baldır serumu	Biyoind	04-001-1A
Rekombinant fare M-CSF proteini	AR-GE	Q3U4F9
Rekombinant fare RANKL proteini	AR-GE	Q3TWY5
RBC lizis tamponu	Beyotime	C3702
Tripan mavisi	Sigma-Aldrich	302643
aseton	Şangay Kimya Co., Ltd.
Sitrat çözeltisi	Sigma-Aldrich	915
Formaldehit çözeltisi	Şangay Kimya Co., Ltd.
Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Hızlı Garnet GBC Base çözümü	Sigma-Aldrich	3872
Sodyum Nitrit Çözeltisi	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Fosfat Çözeltisi	Sigma-Aldrich	3871
Asetat çözeltisi	Sigma-Aldrich	3863
Tartarat çözeltisi	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu	Corning	21-031-CVR
% 37 formaldehit	Xilong bilimsel
IX71	Olympus
0,45 mm Şırınga
makasla kesmek
Sivrisinek forsep

Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi adet Serisi