Alizarin Kırmızı Boyama: Kültürlenmiş Osteoblastlarla Mineralizasyonu Görselleştirme Tekniği

Özet

Kaynak: Kampleitner, C., et al. Kemik Rejenerasyonu için Biyomalzemeler Üzerinde Biyolojik Uyumluluk Profili. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, Alizarin Kırmızı boyası kullanılarak kültürlenmiş primer osteoblastlarda mineralizasyon veya kalsiyum birikiminin derecesini tespit etmek için bir boyama tekniğini göstermektedir.

Protokol

1. Alizarin Red S (ARS) ile boyanarak değerlendirilen osteoblast (OB) mineralizasyonu

1. Bir kültür plakasında biyouyumlu bir iskele olarak kullanılan β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) disklerine birincil osteoblastlar (OB'ler) ekleyin.
2. Mineralizasyon ortamının eklenmesinden 14 gün sonra birincil OB'leri içeren kuyucuklardan kültür ortamını aspire edin ve RT'de 0.5 mL 1x PBS ile iki kez durulayın. PBS'yi aspire edin ve RT'de 10 dakika boyunca% 10 tamponlu formalin çözeltisinin 0.5 mL'sini ekleyerek hücreleri sabitleyin.
3. %10 tamponlu formalini tek kullanımlık bir pipetle aspire edin ve 0,5 mL ultra saf su ile iki kez yıkayın.
4. Sabit OB'lere, ultra saf suda çözülmüş 0.25 mL 40 mM ARS boyama çözeltisi (pH 4.2) ekleyin ve plakayı RT'de 10 dakika boyunca 100 çalkalayıcı / dk'da bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
5. Boyama solüsyonunu tek kullanımlık bir pipetle aspire edin ve 1 mL ultra saf su ile durulayın. Belirsiz lekelenmeyi gidermek için bu adımı 5-10 kez tekrarlayın.
   not: Durulama çözeltisi renksiz olmalıdır.
6. Ultra saf suyu aspire edin ve 1 mL soğuk PBS ekleyin. Plakayı RT'de 10 dakika boyunca 100 shake / dk'da bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
7. PBS'yi aspire edin, lekeli β-TCP diskleri yeni bir kuyuya aktarın ve mineralizasyonu kaydetmek için plakaları düz yataklı bir tarayıcı ile tarayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
β-trikalsiyum fosfat diskler (β-TCP, 14 mm)			Diskler, 1150 ° C sıcaklıkta bir kül fırınında sinterlendi. Üretimin ayrıntılı bir açıklaması Zimmer ve ark. (doi: 10.1002/jbm.a.34639) içinde bulunabilir. Numuneler, hücre kültürlerinde kullanılmadan önce UV ışınlandı (her iki taraf için 15 dakika).
Orthovita Vitoss köpüğü (β-TCP/C köpüğü)	Ortovita	2102-1405
Alizarin Kırmızı S	Sigma-Aldrich	A5533
Formalin çözeltisi nötr tamponlu %10	Sigma-Aldrich	HT501128
Osteojenik mineralizasyon ortamı (MM)			α-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin-streptomisin + 50 μg / mL askorbik asit + 5 mM β-gliserofosfat
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Termo Balıkçı Bilimsel	10010023
Ultra saf su: Hücre kültürü suyu pirojen içermez	VWR (VWR)	L0970-500
Yıkama tamponu			1x PBS'ye %0,05 Tween20 ekleyin.
24 oyuklu süspansiyon kültür plakası	Greiner biyo-bir	662102
Düz yataklı tarayıcı: Epson Perfection 1200 Photo	Epson'un
Tek kullanımlık pipet: serum pipeti	Greiner biyo-bir	612301
Damıtılmış su	Carl Roth'un fotoğrafı	3478.4
Tek kullanımlık pipet: serum pipeti	Greiner biyo-bir	612301

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi .