$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Gümüş boyama protokolü
- Gümüş boyama için gerekli tüm solüsyonları önceden hazırlayın (Tablo 1).
not: PAGE jeline lekelenene, geliştirilene ve durdurma solüsyonuna yerleştirilene kadar doğrudan dokunmayın. Bunun yerine, temiz plastik veya cam aletler kullanarak jeli manipüle edin. Jelin doğrudan ele alınması, boyamadan sonra jel üzerinde parmak izi bozulmalarına ve diğer görünür artefaktlara neden olacaktır.
- Çalışma tamamlandığında, kaseti sökün ve deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suyla dolu temiz, orta-büyük bir kapta jeli çıkarın.
not: Jeli doğrudan tutmaktan kaçınmak için, suya batırılmış durumdayken jeli kasetten nazikçe soymak için pipet ucu veya başka bir plastik nesne kullanın. Jel kırılgan olabilir - dikkatli kullanın.
- Suyu atın. Jeli Alcian mavisi boyama solüsyonunda 5 dakika boyayın.
- Alcian mavisi lekesini atın. Alcian mavisi boyama solüsyonunun çoğu giderilene kadar 2-3x'i deiyonize edilmiş, filtrelenmiş su ile hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
- Rocker üzerinde gece boyunca deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda lekenin çıkmasına izin verin. Kalan lekenin gece boyunca jelden tamamen yıkanmasını sağlamak için bol miktarda deiyonize edilmiş, filtrelenmiş su olduğundan emin olun.
- Jeli% 50 metanolde yıkayın (toplam 40 dakika, çözeltiyi 2-3 kez değiştirin).
- Jeli deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde suyu değiştirerek toplam 2 saat boyunca 3 kez daha tekrarlayın.
- Taze, temiz bir kapta, jeli gümüş nitrat boyama solüsyonunda 30 dakika boyunca lekeleyin.
- Gümüş lekeleme solüsyonunu tamamen çıkarmak için 2-3 kez deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
- Deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde su banyosunu değiştirerek toplam 90 dakika boyunca 2 kez tekrarlayın.
- Suyu atın ve geliştirici çözelti ekleyin.
- Gelişen çözelti eklendikten sonra, jeli dikkatlice gözlemleyin ve bantların görünümünü izleyin. Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir.
- İstenilen bantlar görünür görünmez, gelişmekte olan solüsyonu hemen atın ve durdurma solüsyonu ile kısa bir süre yıkayın.
- Durdurma solüsyonunu atın, yıkayın ve taze durdurma solüsyonu ile değiştirin. Bir külbütör veya çalkalayıcı üzerinde 1 saat bekletin.
- Gece boyunca deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suda yıkayın (ancak jel, çözelti yıkamayı durdurduktan hemen sonra görüntülenebilir).
Tablo 1: Poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılan glikozaminoglikanların gümüş boyaması için gerekli çözeltiler. Kullanmadan önce tüm çözeltiler filtrelenmelidir (0.22 μm).
TL
| NOT: Kullanmadan önce tüm solüsyonlar filtrelenmelidir (0.22μm). |
| çözüm | yemek tarifi | kompozisyon | Yorum |
| Alcian mavisi boyama solüsyonu (500mL) | Alcian mavisi 8GX tozu | 2.5g | İstenilen konsantrasyon: %0,5 w/v |
| % 2 V / V buzlu asetik asit | 500 milyon | |
| Gümüş leke (200 mL) | Deiyonize su | 192,7 mL | Leke çözeltisini taze hazırlayın; bir hafta içinde kullanın. |
| 7.6M sodyum hidroksit | 2 mL | Yapmak için 10 mL suya 3,04 g sodyum hidroksit peletleri ekleyin |
| Amonyum hidroksit | 3.3 mL | |
| 4M gümüş nitrat çözeltisi | 2 mL | Yapmak için 5 mL suya 3.397 g gümüş nitrat ekleyin. Çökelmeyi önlemek için karıştırırken damla damla ekleyin. |
| Çözüm geliştirme (501 mL) | Deiyonize su | 500 mL | Geliştirilen çözelti taze hale getirilmeli ve 24 saat içinde kullanılmalıdır. |
| %2,5 w/v sitrik asit | 1 mL | Yapmak için 100 mg ila 4 mL deiyonize su ekleyin. Sitrik asit taze yapılmalıdır. |
| Formaldehit | 250μL | |
| Çözeltiyi durdur (500 mL) | Deiyonize su | 300 mL | |
| Buzlu asetik asit | 20 mL | |
| metanol | 90 mL | |