Koloni Oluşumu Testi için Giemsa Boyama: Mezenkimal Kök Hücrelerin Proliferatif Yeteneğini Değerlendirmek İçin İn Vitro Boyama Prosedürü

Özet

Kaynak: Schlaefli, P. et al. Pıhtılaşmış Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreleri Kurtarmak İçin Enzimatik Bir Yöntem. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, mezenkimal kök hücrelerin canlı koloniler oluşturmak için proliferatif potansiyelini değerlendirmek için Giemsa boyama prosedürünü gösteriyoruz. Giemsa boyası, esas olarak masmavi ve eozin boyalarından oluşan ve yüklerine bağlı olarak hücresel bileşenler için seçici afinite taşıyan nötr bir boyadır.

Protokol

1. Genleşme Hücre Kültürü ve CFU Plakaları için Tohumlama

1. Hücreleri (eritrositler ve mononükleer hücrelerden oluşan) 50 ml bazal ortamda yeniden süspanse edin:% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2.5 mg / ml amfoterisin B ile desteklenmiş Alfa-MEM. Bir Neubauer odası kullanarak Tripan Mavisi çözeltisinde 1:10 oranında seyreltilmiş hücreleri sayın.
2. Hücreleri 5 x 10⁷ hücre/cm² yoğunlukta hücre kültürü şişelerine yerleştirin ve 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Varsa, hipoksik (% 5 oksijen) koşulları kullanın. CFU tahlil kontrolü için, 10 cm çapında bir hücre kültürü kabında 10⁹ hücreleri plakalayın.
3. 3 günlük kültürden sonra, mezenkimal kök hücreler hücre kültürü kabına bağlanırken diğer hücreler süspansiyon halinde kalır. Besiyerini 5 ng/ml bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmiş bazal besiyeri ile değiştirin. CFU tahlil kontrolü için, hücre kültürü kabına da aynı şekilde muamele edin.
4. Hücre kültürüne toplam 2 hafta devam edin, haftada üç kez ortam alışverişi yapın. Hücreler% 80 birleşmeyi aşarsa, tripsinizasyon ile bölünür. CFU tahlil kontrolü için, ortamı aynı şekilde değiştirin, ancak iki hafta boyunca hücreleri bölmeyin.

2. CFU Testi için Giemsa Stain

1. Tabak başına 10 ml Giemsa çözeltisi hazırlayın: stok çözeltisini (gliserol: metanol içinde 7.6 g / l Giemsa) steril suda 1:10 oranında seyreltin (her zaman taze bir çalışma seyreltmesi hazırlayın).
2. Ortamı hücre kültürü kabından çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Petri kabına sıvı uygularken çok dikkatli olun ve hücreleri yıkamaktan kaçının.
3. Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca saf Metanol içinde sabitleyin. Metanolü atın. Giemsa solüsyonunu ekleyin ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 60 dakika inkübe edin.
4. PBS ile iki kez yıkayın. Tabak kafasını önce bir kağıt havlu üzerinde havayla kurutun. Kolonileri manuel olarak sayın. Bu en iyi şekilde plakanın arkasındaki bir işaretleyici kalem kullanılarak elde edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bazal Ortam Bileşenleri
PenStrep 100X	Gibco (Gibco)	15140122
İnsan FGF-temel	Peprotech teknolojisi	100-18B
MEM Alpha, Nükleosit, kararlı Glutamin ile	Amimed	1-23S50-I
FBS Isı İnaktif Hale Getirildi	Amimed	2-01F36-I
Amfoterisin B	Uygulama	A1907
jenerik
Pbs	Uygulama	964,91
Giemsa lekesi	Uygulama	A0885
Sarf
Primaria hücre küpü kabı	doğan	353803
Hücre kültürü şişesi - Şişe T300	TPP (Cesaret Partisi	90301
ekipman
Striptizler Serolojik Pipet 5ml	Corning	4487-200 adet
Nemlendirilmiş inkübatör Heracells 240	Termo bilimsel	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Termo bilimsel	75004331

Serisi Serisi numaralı telefondan temin edilmiştir.