$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>NOT: İlyak tepeden köpek kemik iliği aspiratları köpek sahibinin rızası ile toplanmıştır. Köpek (yaklaşık 10 ml) kemik iliği aspiratları, ameliyathanede çekildikten hemen sonra 15 ml %3.8 sodyum sitrat ilavesiyle antikoagüle edildi. Numuneler geri çekilmiş olarak aynı gün işlenmek üzere laboratuvar ortamına aktarıldı.
1. Ürokinaz Hazırlanması (1. Kullanımdan Önce)
- Üreticinin talimatlarına göre steril fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak ürokinazı sulandırın: 10 ml'lik bir şırınga kullanarak septum giriş şişesine 10 ml PBS ekleyin. Ml başına 50.000 enjeksiyon birimi (U) elde etmek için kuru maddeyi döndürerek çözün.
- Steril tüplere 500 μl alikot (her biri 25.000 U) hazırlayın. Alikotları -20 °C'de saklayın ve gerektiğinde en az 6 ay boyunca kullanın.
2. Hazırlık Adımları (Her Kemik İliği Tedavisinden Önce)
- Pıhtılaşmış kemik iliği aspiratı başına bir ürokinaz alikotunu (25.000 U) çözün (25 ml'ye kadar olan aspirat hacimleri, 25.000 U'luk tek bir alikot kullanılarak başarıyla tedavi edilmiştir).
- Bir su banyosunu veya çalkalama inkübatörünü önceden 37 °C'ye ısıtın.
3. Pıhtının Enzimatik Sindirimi
- İşleme sırasında kemik iliği numunelerinin mikrobiyal kontaminasyonunu önlemek için tüm çalışmaları laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Potansiyel olarak bulaşıcı insan materyali ile çalışırken, koruyucu eldivenlerin kullanılması ve dikkatli kullanılması tavsiye edilir.
- 50 ml'lik steril bir tüpün üzerine 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Kemik iliği aspiratını hücre süzgecinden dikkatlice dökün, süzgeci eğin yanından geçirin veya pıhtı materyalinin etrafında hareket ettirin. Filtre ağından daha iyi akış için steril bir pipet ucu kullanın.
not: Pıhtının herhangi bir şekilde seyreltilmesinden kaçının, örneğin pıhtıyı PBS ile yıkayarak. Ürokinaz dolaylı olarak etki eder ve etkili sindirim için biyopsiden serumun bileşenlerini (yani plazminojen) gerektirir. Pıhtı materyali ile işleme devam ederken, süzüntü adım 3.6'da daha fazla kullanılana kadar RT'de tutulabilir.
- Kemik iliği pıhtı materyalini steril forseps kullanarak boş bir hücre kültürü kabına aktarın. Steril bir neşter kullanarak kalıntıları yaklaşık 2 mm'lik3 küçük parçalar halinde kesin.
- Pıhtının küçük parçalarını steril forseps kullanarak 50 ml'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Kıyılmış pıhtının ıslak bir görünüme sahip olduğundan emin olun. Kuru görünüyorsa, nemlendirmek için adım 3.1'deki süzüntülerin bir kısmını kullanın.
- 5 ml'lik bir mikrotitre pipet kullanarak 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek pıhtıyı ezin. Numuneye 1 alikot ürokinaz ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika boyunca ya bir su banyosunda ya da çalkalanan (nazikçe) bir inkübatörde inkübe edin.
- 5 ml'lik bir pipet kullanarak 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek eziyet edin. Bu adımı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. 37°C'de 30 dakika daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 5 ml'lik bir pipet kullanarak tekrar 5 kez ezin. Adım 3.2'den itibaren süzüntü ile havuza girmek için 100 μm'lik taze bir hücre süzgecinden geçirin.
- Hücre süspansiyonunu ortam sıcaklığında 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini aşağıda açıklandığı gibi veya MSC genleşme kültürü için laboratuvarınızın standart prosedürüne göre ortamda yeniden süspanse edin.
4. Genleşme Hücre Kültürü ve CFU Plakaları için Tohumlama
- Hücreleri (eritrositler ve mononükleer hücrelerden oluşan) 50 ml bazal ortamda yeniden süspanse edin:% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2.5 mg / ml amfoterisin B ile desteklenmiş Alfa-MEM. Bir Neubauer odası kullanarak Tripan Mavisi çözeltisinde 1:10 oranında seyreltilmiş hücreleri sayın.
- Hücreleri 5 x 107 hücre/cm2 yoğunlukta hücre kültürü şişelerine yerleştirin ve 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. Varsa, hipoksik (% 5 oksijen) koşulları kullanın. CFU tahlil kontrolü için, 10 cm çapında bir hücre kültürü kabında 109 hücreyi plakalayın.
- 3 günlük kültürden sonra, mezenkimal kök hücreler hücre kültürü kabına bağlanırken diğer hücreler süspansiyon halinde kalır. Besiyerini 5 ng/ml bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmiş bazal besiyeri ile değiştirin. CFU tahlil kontrolü için, hücre kültürü kabına da aynı şekilde muamele edin.
- Hücre kültürüne toplam 2 hafta devam edin, haftada üç kez ortam alışverişi yapın. Hücreler% 80 birleşmeyi aşarsa, tripsinizasyon ile bölünür. CFU tahlil kontrolü için, ortamı aynı şekilde değiştirin, ancak iki hafta boyunca hücreleri bölmeyin.
5. MSC Farklılaşması
- Köpek MSC'lerinin farklılaşması
not: Köpek MSC'leri, dört hafta boyunca uygun besiyeri ile stimülasyon yoluyla kondrojenik, osteojenik ve adipojenik soylara ayrıldı.
- Kondojenik farklılaşma
- Liyofilize kollajen tip I'den oluşan sünger şeklindeki bir tıbbi cihazdan küpler (her tarafta 3 mm) kesin ve hücreleri desteklemek için iskele malzemesi olarak kullanın.
- Küplerin üstündeki MSC'leri 4 x 106 hücre / ml (~ 70.000 hücre / küp) konsantrasyonunda tohumlayın.
- Ortam eklemeden önce, hücrelerin 30 dakika boyunca küplere yapışmasına izin verin.
- DMEM / F12 + GlutaMAX,% 2.5 FBS, 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 μg / ml amfoterisin B, 40 ng / ml deksametazon, 50 μg / ml askorbik asit 2-fosfat, 50 μg / ml L-prolin, 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum X ve 10 ng / ml dönüştürücü büyüme faktörü-β1.
- Yapı bölümlerinde proteoglikan birikimini görselleştirmek için alcian mavisi boyamayı kullanın. Kısaca, O / N bölümlerini% 0.01 H2S04 ve 0.5M guanidin hidroklorür içinde çözülmüş% 0.4 alcian mavisi ile boyayın. Daha sonra, bölümleri% 40 DMSO ve 0.05M MgCl2'de 30 dakika boyunca yıkayın. Hücreler nükleer hızlı kırmızı ile boyandı.