Sudan IV Boyama: Hasat Edilmiş Fare Aort Arkında Lipid Yüklü Aterosklerotik Plakların Boyanması İçin Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Centa, M., et al. Farelerde Aterosklerozun Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, aterosklerotik plakları görselleştirmek ve aterosklerozun derecesini belirlemek için hasat edilen fare aort kemerindeki yağ birikintilerini boyamak için Sudan IV boyasının kullanıldığı bir prosedür gösterilmektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

.

1. Aort Arkı ve Brakiyosefalik Arterin En Yüz Analizi

1. Aort kemerlerinin yüz analizi için sabitleme yatakları hazırlayın. 25 mm x 25 mm'lik düz bir yüzey elde etmek için bir parafin balmumu filmi parçasını sekiz kez katlayın. Aort için koyu bir arka plan oluşturmak için siyah elektrik yalıtım bandı ile sarın. Sabitleme yatağının arkasına bir etiket yerleştirin ve fare kimlik numarasını yazmak için kurşun kalem kullanın (normal kalem mürekkebi boyama işleminde kaybolacaktır).
2. Aort arkını sabitleme yatağına aktarın ve üzerine bir damla PBS yerleştirin. Stereomikroskop altında aortu kalan periadventitial yağ dokusundan temizlemeye başlayın.
   1. Aortu manipüle etmeden veya zarar vermeden çevredeki tüm yağ dokusunu nazikçe soymak için Vannas makası ve Dumont forseps kullanın. Sudan IV, yağ dokusunu parlak bir şekilde boyayacaktır ve bu noktada tüm bu dokuların çıkarılması çok önemlidir.
      not: Aortu her zaman nemli tutun ve gerektiğinde ek PBS uygulayın.
3. İntimal yüzeyi ortaya çıkarmak için aort lümenine Vannas makasını sokarak koronal düzlemde aortu kesin. Yükselen arkın dış eğriliğini distal yönde kesmeye başlayın ve brakiyosefalik arter de dahil olmak üzere dalları kesmeye devam edin. İnen torasik bölgenin dorsal kısmını yedekleyin.
   1. Daha küçük eğriliği kesin ve intimal yüzeyi görüntülemek için aortu katlayarak açın.
      not: Bu adım, ince motor beceriler gerektirir ve ustalaşmak için biraz pratik gerektirir.
4. Minutien böcek pimlerinin kör ucunu kullanarak açık kemeri sabitleme yatağına sabitleyin. Pimleri yerine yerleştirmek için bir mikro Castroviejo iğne tutucusu kullanın. Yerindeyken pimleri numuneden yavaşça bükün. Numuneyi germeden aortu yatağa düz bir şekilde sabitleyin. Sabitlenmiş kemeri aşağı bakacak şekilde 4 °C.
   sıcaklıkta PBS ile doldurulmuş bir Petri kabında saklayın not: Protokol buradan duraklatılabilir.
5. Sudan IV'ün çalışan bir çözümünü hazırlayın. 1 g Sudan IV tozu, 100 mL %70 etanol ve 100 mL asetonu koyu renkli bir şişede karıştırın ve 10 dakika hafifçe karıştırın. Çözeltiyi filtrelemeye gerek yoktur ve oda sıcaklığında karanlık tutulursa birkaç ay kullanılabilir. Boyama rengi tatmin edici değilse, yeni bir çözelti yapılabilir ve numuneler tekrar boyanabilir.
   Dikkat: Aseton, ciddi göz tahrişine neden olabilecek yanıcı bir sıvıdır. İyi havalandırılan bir yerde saklayın ve kullanım sırasında ihtiyati tedbirler alın.
6. Laboratuvar tezgahına beş Petri kabı yerleştirin: biri %70 etanol ile doldurulmuş, biri Sudan IV çalışma solüsyonu ile doldurulmuş, ikisi %80 etanol ile doldurulmuş ve biri PBS ile doldurulmuş.
   1. Numuneyi %70 etanol içinde 5 dakika boyunca durulamaya başlayın, sabitleme yatağını kemer aşağı bakacak şekilde ilk Petri kabına yerleştirin. Numuneyi Sudan IV çalışma solüsyonuna aktarın ve kemeri 7 dakika boyunca lekelemesine izin verin.
   2. Daha sonra, normal intimal yüzeyi lekelemek için% 80 etanol içinde iki kez iki kez 3 dakika durulayın. Sonuçları optimize etmek için leke çıkarma süresi ayarlanabilir. Son olarak, numuneyi orijinal Petri kabına geri koymadan önce PBS'de durulayın.
7. Bir dijital kameraya bağlı 10 kat büyütmede bir stereomikroskop kullanarak mikrograflar elde edin. Sabitleme yatağını bir Petri kabının dibine tutmak için küçük metal ağırlıklar (20 mm x 10 mm x 5 mm) kullanarak PBS'ye batırılmış pimli kemerin fotoğraflarını çekin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Siyah elektrik yalıtım bandı (50 mm genişliğinde)	Herhangi bir uzman perakendeci		Aort kemerleri için sabitleme yatakları oluşturmak için.
Diseksiyon makası (10 cm, düz)	Dünya Hassas Aletler	14393	Organların genel diseksiyonu için.
Dumont forseps #5 (11 cm, düz)	Dünya Hassas Aletler	500341	Aort mikrodiseksiyonu için.
Etanol %70 (h/h)	VWR Kimyasalları	83801.29	Son derece yanıcı sıvı ve buhar, iyi havalandırılan bir yerde saklayın ve serin tutun.
Etanol mutlak ≥99.8%	VWR Kimyasalları	20821.31	Son derece yanıcı sıvı ve buhar, iyi havalandırılan bir yerde saklayın ve serin tutun.
Formaldehit %4 stabilize, tamponlu (pH 7.0)	VWR Kimyasalları	9713.1	Solunması, cilt ile teması ve yutulması halinde zararlıdır.
İzopropanol	Merck	1096341011	Yanıcı sıvı, ciddi göz tahrişine neden olur ve uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olabilir.
Mikro Castroviejo iğne tutucu (9 cm, düz)	Dünya Hassas Aletler	503376	Aort kemerlerinin sabitlenmesi için.
Minutien böcek pimleri, 0,10 mm	Güzel Bilim Araçları	26002-10	Aort kemerlerinin sabitlenmesi için.
Parafilm M	Bemis	PM992	Parafin balmumu filmi, aort kemerleri için sabitleme yatakları oluşturmak için kullanılır.
Fosfat tamponlu salin (PBS)	-	-	Farelerin perfüzyonu için steril ve RNaz içermeyen çözelti gereklidir
Stereomikroskop	Leica Mikro Sistemler	MZ6	Diseksiyon ve yüz dokümantasyonu için
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261 Serisi	Tehlikeli madde veya karışım olarak sınıflandırılmamıştır.
Vannas makas (8 cm, düz)	Dünya Hassas Aletler	503378	Aort mikrodiseksiyonu için.

(İngilizce) (İngilizce) Serisi Gazetesi