Lignini Görselleştirmek için Wiesner Boyama: Arabidopsis thaliana'nın Gövdelerinde Bulunan Lignin Birikintilerini Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Pradhan Mitra, P. et al., Arabidopsis thaliana İkincil Hücre Duvarı Elemanlarının Histokimyasal Boyanması. J. Vis. Uzm. (2014).

Bu videoda, özel bitki hücrelerinde bulunan lignini boyamak için Wiesner boyama tekniğini açıklıyoruz. Bu boyama tekniği, Arabidopsis thaliana saplarındaki odunlaşmış hücre duvarlarını görselleştirmeye yardımcı olur ve farklı hücre tiplerinin hücre duvarlarındaki odunlaşmanın miktarını belirlemeye yardımcı olur.

Protokol

1. Kök Gömme

1. Suda% 7'lik bir agaroz çözeltisi yapın (100 ml damıtılmış suda 7 g elektroforez dereceli agaroz). Agarozu 20 dakika otoklavlayarak veya en düşük yoğunlukta 20 dakika mikrodalgada pişirerek çözün (örneğin, 1.250 watt'lık bir mikrodalga fırının %10 yoğunluğu).
2. Plastik şişeler kullanarak sapları gömmek için ev yapımı bir kalıp hazırlayın.
   1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, 2 ml'lik vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpünün (Bölüm A) konik tabanını kesin. Bir şırınga iğnesi ile, tüp kapağına gömülecek sapın çapından biraz daha büyük bir delik açın. Ardından, 0,6 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünün (Bölüm B) altından 0,5 cm kesin.
   2. 0,6 ml'lik mikrosantrifüj tüpünün 0,5 cm'lik kesik kısmını önceden kesilmiş 2 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Parafilm kullanarak iki parçayı kapatın (Şekil 1).
      not: Tüpün alt kısmı, agaroz katılaştıktan sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. Kapaktaki delik, gövde agaroza gömüldüğünde gövdenin sabit tutulmasına yardımcı olacaktır. Kalıp, agarozu tutmaya ve gömme sırasında gövdeyi düz tutmaya hizmet edecektir. Parafilm, agaroz ayarlanana ve gövde gömülene kadar A ve B olmak üzere iki parçayı tutacaktır.
   3. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ilgilenilen alandan bir gövde bölümü kesin (örneğin, ilk gövde ara düğümünün ortasında).
      not: İdeal olarak, dehidrasyon yoluyla tahribatı önlemek için gövde gömülmeden hemen önce kesilmelidir. Alternatif olarak, gövde geçici olarak suyla ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren bir plakada saklanabilir. Bu plaka, doku dehidrasyonunu ve deformasyonunu önlemek için gömülmeye hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Sapı yüksek nem olmadan 30 dakikadan daha uzun süre saklamak, sapın kurumasına neden olur.
3. Agarozu mikrodalgada düşük yoğunlukta eritin.
   Dikkat: Agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişeyi almak için bir eldiven kullanın. Erimiş agarozu oda sıcaklığında (20 °C ile 25 °C arasında) yaklaşık 50 °C'ye soğuyana kadar bekletin.
4. Şişeyi doldurmak için 5 ml agarozu önceden hazırlanmış plastik kalıba yavaşça pipetleyin.
   not: Kalıplarda hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları, agaroz kalıbında boşluklara neden olacak ve gövde numunesini tamamen kaplamayacaktır, bu da sonunda numune bölümlerinin eşit olmayan şekilde kesilmesine yol açacaktır.
   1. Agarozun yarı katı hale gelmesi için 30 ila 60 saniye soğumaya bırakın. Küçük bir kürdan ile test edin, agarozun içine nüfuz edip ayağa kalkabildiğinden, ancak yüzemediğinden emin olun.
      not: Gövde, agaroz hala sıcakken yerleştirilirse, gövdeyi buruşturarak numuneye zarar verir ve hücre morfolojisini tahrip eder.
   2. Sapı bu agaroz dolgulu şişeye yerleştirin. Sapın düz kaldığından emin olun. Delikli kapağı, sapın ucu kapak tarafından tutulacak şekilde yerleştirin. Vidalı kapağı çevirmeyin. Bazen birden fazla gövde (tek bir türden) tek bir şişeye gömülebilir; Ancak bu durumda, Cap.
      not: Vidalı kapak döndürülürse, gövde bükülür.
5. Şişeyi oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 10-30 dakika katılaşana kadar bırakın.
6. Kalıbı yavaşça borudan dışarı kaydırarak çıkarın. Parafilm'i açın. Katılaşmış agarozu Kısım A'dan bir cam mikroskop lamı üzerine bırakmak için kalıbın B Kısmının altını baş parmağınızla hafifçe itin.
7. Agaroz gömülü gövdeyi yaklaşık 1,2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya kesin. Sapın agarozda olmayan kısmını kesin ve atın.
   1. Bu agaroz parçalarını, gömülü sapları ile birlikte hava geçirmez 2 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde, bölüme hazır olana kadar karanlık bir kutuda 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, tüpleri en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
      not: Depolama mümkündür, ancak deneycinin gömülü gövdelerin hala canlı olduğunun ve deneye bağlı olarak artefaktların potansiyel olarak ortaya çıkabileceğinin farkında olması gerekir.

2. Kök Kesit Alma

DİKKAT: Vibratom kılavuzunu dikkatlice okuyun ve tüm güvenlik talimatlarına uyun.

1. Numune diskinin temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun (herhangi bir katı veya sıvı içermez). Önceki deneylerden kalan yapıştırıcıyı çıkarmak için numune diskini bir tıraş bıçağıyla temizleyin ve suyla yıkayın. Ardından bir kağıt havluyla kurulayın.
   not: Bu, yapıştırıcının iyi çalışmasını ve agaroz örneğine bağlanmasını sağlayacaktır. Bu adım düzgün bir şekilde yapılmazsa, numunenin diske yapışmaması ve daha sonra numunenin kesit alma sırasında diskten düşmesine neden olması mümkündür.
   1. Numuneleri içeren agaroz bloğundaki nemi gidermek için yumuşak kağıt mendiller kullanın.
   2. Numune diskinin üzerine küçük bir damla doku yapıştırıcısı yerleştirin. Yapışkan şişenin ucunu kullanarak plakanın ortasındaki alanı kaplayacak şekilde yapıştırıcıyı çizin. Agaroz bloğunu, numuneler sırasıyla enine veya boyuna kesitler için plakaya dik veya plakaya paralel olacak şekilde hızlı bir şekilde yerleştirin. Yapıştırıcının numuneyi oda sıcaklığında veya 4 °C'de 10-30 dakika boyunca numune diskine sabitlemesine izin verin. NOT: Bu, zamana duyarlı bir adımdır.
2. Numune diskini tampon tepsisi veya oluk üzerindeki yerine sabitleyin. Bölümlerle agaroz blokları / blokları tıraş bıçağına paralel olmalıdır. Tampon tepsisini, numuneler tamamen suya batırılana kadar oda sıcaklığında damıtılmış suyla doldurun.
3. Bir tıraş bıçağını ikiye bölün ve ardından bıçağın tamamen düz kalması için uçlarını sağlam bir makasla kesin. Önceden kesilmiş tıraş bıçağının yarısını bıçak tutucusuna takın.
   1. Bıçak tutucunun açısını 84°'ye, hızı 0,90 mm/sn'ye (vibratomda konum 8) ve frekansı 50 Hz'e (vibratomda konum 5) ayarlayın. 100 μm kalınlığında kesitler kesin. Sürekli modu kullanın. not: Bu kalınlık, dokunun bazı boyama protokollerinde kullanılan çeşitli asit ve baz işlemlerine dayanabilmesini sağlamak için seçilmiştir. Pencereyi kesit için ayarlayın ve vibratomun yaklaşık 1,2 cm'lik bir agaroz bloğunu kesit alması için sürekli modda 15-20 dakika bekleyin.
4. Tampon tepsisinde bölümlere ayırma sırasında tek kullanımlık bir plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, bölümler tampon tepsisinden bir cam behere ve daha sonra şeffaf bir Petri plakasına aktarılabilir. Birkaç bölümü 2.0 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Not: Örnekler bir Petri plakasından toplanır, çünkü bölümleri net bir arka plan üzerinde görmek daha kolaydır ve tampon tepsisi bir sonraki örnek için hazırlanabilir.
5. Bölümler 50 ml'lik bir tüpte saklanabilir veya 1.5 ila 2 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde 4 ° C'de 30 ila 60 dakika boyunca toplanabilir ve saklanabilir
   not: Bölümlerin daha uzun süre saklanması görüntü kalitesinin düşmesine neden olur.

3. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama

1. % 3'lük bir phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için 0.3 g phloroglucinol'ü 10 ml mutlak etanol içinde çözün. Etanol içinde bir hacim konsantre HCl (37 N) ile iki hacim% 3 phloroglucinol karıştırın; bu çözelti phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) veya Wiesner boyasıdır.
   not: Bu çözelti, lekelenme günü taze olarak yapılmalıdır ve saklanamaz, çünkü çözelti zamanla bozulur ve lekelenme etkisiz hale gelir.
   Dikkat: HCl oldukça aşındırıcıdır, bu nedenle Ph-HCl lekesini tutarken çok dikkatli olun.
2. Gövde bölümlerini 2.0 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bölümleri içeren tüpe 1 ml Ph-HCl solüsyonu ekleyin ve hemen kapatın çünkü Ph-HCl boyasındaki HCl oldukça aşındırıcıdır. Tüm bölümlerin lekeli olduğundan emin olmak için tüpü yavaşça hareket ettirin. Bu adıma bir alternatif, Ph-HCl çözeltisinin tercihen bölümleri bozmadan yukarı ve aşağı pipetlenebilmesi için tüp kapağını açık tutmaktır.
   not: Bu bölümlere zarar verebileceğinden, bölümleri pipet ucuna pipetlememeye dikkat edin.
   1. Pipet ucu, bölümler zarar görmeden kolayca pipetlenebilecek şekilde kesilmiş 1 ml'lik bir pipet kullanın. Bölümleri yavaşça uca ve bir mikroskop lamına pipetleyin. Bölümleri kapak fişi ile örtün. Parlak alan aydınlatması altındaki bölümleri gözlemleyin. (Şekil 2)
      not: Ph-HCl çözeltisi 5-10 dakika içinde kurur ve numunelerin bozulmasına neden olur. Bu nedenle, görüntülemenin bu süre içinde tamamlanması gerekir.

Sonuçlar

Şekil 1. Sapları gömmek için ev yapımı kalıp.Sol tarafta; 2 ml'lik vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpünün üst kısmı (Bölüm A) ve alt kısmı 0.6 ml mikrosantrifüj tüpünün (Bölüm B). Sağ tarafta; iki parçayı tutan Parafilm; Son kalıbı oluşturmak için A ve B.

Şekil 2. A. thaliana gövde kesitlerinin floroglusinol-HCl boyamas...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
agaroz	EMD (Türkçe)	MERC2125	CAS Numarası: 9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-trihidroksibenzen [CAS Numarası: 108-73-6]
hidroklorik asit	EMD (Türkçe)	HX0603-75	CAS Numarası: 7647-01-0
Etanol 190 geçirmez	KOPTEC BELEDIYESI	V1401 Serisi	CAS Numarası: 64-17-5
Vibratom	Leica Belediyesi	Leica Titreşimli bıçak mikrotom VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ Ürünler/Kesit/titreşimli bıçak-mikrotomlar/detaylar/ürün/ leica-vt1000-s/
jilet	Amerikan Güvenlik tıraş bıçağı şirketi	Ürün # 60-0139-0000	Paslanmaz Çelik Çift Kenarlı Bıçak (Personna Super)
Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri (2 ml)	VWR (VWR)	16466-044
Mikrosantrifüj Tüpleri (0.6 ml)	Axygen Bilimsel	MCT-060-C
Doku yapıştırıcısı	Ted Pella A.Ş.	10033	3 ay veya daha uzun süre saklamak için 4 °C veya 20 °C'de saklayın
Mekanik deklanşörü olmayan CCD çipli kamera	Hamamatsu	C4742-95
Kamera yazılımı	Moleküler Cihazlar	MetaMorph sürüm 7.7.0.0
Analitiği hayal etmek	kerpiç	Photoshop CS4
Mikro Kapaklı Camlar, Kare, No. 1	VWR (VWR)	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8 inç) - Kapak camları korozyona dayanıklıdır
Buzlu Mikro Slaytlar, 1 mm	VWR (VWR)	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm